[00316292]柑橘皮渣中生物类黄酮的提取技术

我国柑橘加工业的原料综合利用水平低，每年有占柑橘加工量近一半的皮渣弃而不用，既浪费了资源，又给企业造成了经济损失，增加了产品成本，同时也给环境造成了巨大的威胁。据分析测定，柑橘皮渣中含有较丰富的碳水化合物、矿物质、生物类黄酮等营养成分，生物类黄酮物质主要有花色素苷、黄酮苷和黄烷酮苷三种类型，其含量为果实质量的0.5%左右，以黄烷酮苷最多。甜橙、酸橙和柠檬果实中主要是橙皮苷、葡萄柚和柚果实中主要是柚苷，酸橙和酸柚中主要是柚苷和新橙皮苷。生物类黄酮物质广泛存在于自然界中，多具有艳丽的色泽，在植物体内大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。植物中的生物类黄酮化合物分布广，含量丰富，其中以黄酮醇类最为常见，约占总数的1/2，其次为黄酮类，约占总数的1/4，其余则较少见，至于双黄酮类多局限分布于松柏纲、银杏纲和凤尾纲等植物中。

（一）生物黄酮类化合物的结构与分类

黄酮类化合物，又称生物类黄酮。以前主要是指基本母核为二苯基色原酮类化合物。根据中央3碳键的氧化程度、B-环连接位置（2或3位）以及三碳链是否构成环状等特点，可将重要的天然黄酮类化合物分为黄酮醇、异黄酮、查尔酮、黄烷醇、花青素等，此外，尚有二分子黄酮、二分子二氢黄酮或一分子黄酮、一分子氢黄酮按C—C或C—O—C链方式连接而成的双黄酮类化合物。天然黄酮类化合物多为上述基本母体的衍生物，常见取代基有—OH、—OCH3以及萜类侧链。

（二）产品实现的功能

黄酮类化合物中含有消炎、抑制异常的毛细血管通透性增加及阻力下降、扩张冠状动脉、增加冠脉流量、影响血压、改变体内酶活性、改善微循环、解痉、抑菌、抗肝炎病毒、抗肿瘤等具有重要生物活性的化合物，有很高的药用价值。黄酮类化合物无显著毒性，大鼠口服槲皮素LD50为10～50g/kg，小鼠口服15g/kg，观察7d无一死亡。临床病人摄取芦丁2.25g持续7d或60mg/d连续5年，均无任何副反应。在其他一系列大剂量、长时间的动物试验中，均未发现有致癌性、显性致死试验。细胞染色体试验、微核试验证明槲皮素类衍生物无致突变作用。

1．保护心血管系统 黄酮类化合物具有保护血管脆性、扩张冠状动脉、增加冠脉流量、降低血压、改善微循环等作用，但黄酮类化合物影响毛细血管脆性与渗透性的机制目前尚未弄清。已知毛细血管破损是维生素C缺乏病——坏血病的一个特征，维生素C在维持毛细血管的健康方面十分重要。由于黄酮类化合物与维生素C在自然界总是同时存在，故可推测它们的功能是共同加强毛细血管和调节其渗透性，防止毛细血管与结缔组织的内出血与破裂，共同建立起一个抗传染病的保护屏障。

2．清除自由基 黄酮类化合物是优良的活性氧清除剂和脂质抗氧化剂，其清除自由基和抑制脂质过氧化的机理是：与超氧阴离子反应阻止自由基反应的引发，与Fe2+络合阻止羟基自由基的生成，与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧经过程。黄酮类化合物兼有亲水性和亲脂性，其主要的抗氧化活性基团是酚羟基，特别是苯基B环4＇位羟基和3＇、4＇位的邻二羟基其次是2、3位的双键。黄酮类化合物能抑制脂质过氧化作用，降低血脂及胆固醇。体内的槲皮素能抑制细胞膜脂质的过氧化过程，保护细胞不受过氧化作用的破坏，并能明显抑制血小板聚集，选择性地与血管壁上的血栓结合，起到抗血栓形成的作用。

3．抗肿瘤 黄酮类化合物具有较强的抗肿瘤作用，主要通过3个途径，即对抗自由基作用，直接抑制癌细胞生长，对抗致癌、促癌因子。槲皮素能在毫摩尔的浓度下直接阻滞癌细胞增殖，芦丁和桑色素能抑制苯并芘对小鼠皮肤的致癌作用。黄酮类化合物对许多致癌剂和致癌物也有拮抗作用，如芹菜黄素、山柰酚、槲皮素对黄曲霉素B1与DNA加合物的形成有抑制作用。

4．异黄酮的类似雌激素作用 在高浓度的情况下，异黄酮对肾脏肿瘤细胞胞浆雌二醇受体和乳腺胞浆雌二醇受体均表现出特异性竞争结合。国外流行病因学研究证明，东方人的乳腺癌、结肠癌和大肠癌的发病率远低于西方人，其重要原因是东方人的食物中含有大量的植物雌激素。通过对尿或粪便等排泄物中异黄酮及其代谢产物含量的测定，发现东方人排泄物中这类物质的含量为西方人的10～20倍，并认为异黄酮的抗雌激素作用与其抗激素依赖性乳腺肿瘤的生长有关。

5．抗肝脏毒作用 从水飞蓟种子中得到的水飞蓟素、异水飞蓟素及次飞蓟素等黄酮类物质经动物试验及临床实践均证明有很强的保肝作用。临床上用以治疗急、慢性肝炎，肝硬化及多种中毒性肝损伤等。另外，儿茶素在欧洲也用作抗肝脏毒药物，对脂肪肝及因半乳糖胺或CCl4等引起的中毒性肝损伤均有一定效果。

6．抗炎作用 黄酮类化合物，如芦丁及其衍生物羟乙基芦丁、二氢槲皮素对角叉菜胶等诱发的大鼠足爪水肿、甲醛引起的关节炎及棉球肉芽肿等均有明显抑制作用。据研究，黄酮类化合物的抗炎作用可能与前列腺素生物合成过程中的脂氧化酶受到抑制有关。

7．抗菌及抗病毒作用 木犀草素、黄芩素等均有一定程度的抗菌作用。C黄酮类化合物对金黄色葡萄球菌等具有很强的抗菌活性。槲皮素、桑色素、二氢槲皮素及山奈酚等具有抗病毒作用。

8．解痉挛作用 异甘草素及黄豆苷原等具有类似罂粟碱样的解除平滑肌痉挛作用。大豆苷、葛根素等葛根黄酮类成分可以缓解高血压患者的头痛等症状。 此外，有些黄酮类化合物还具有止咳、祛痰作用，且平喘作用与分子中的α、β-不饱和酮结构有关。 该项目已经有企业而开展应用，合作企业背景： 这是一家中国植物抗病营养素饲料添加剂研发、生产、销售的企业，将黄酮等生物活性有效分更好地添加入植生素中，希望通过新的方法提取黄酮，从而综合提升猪群健康水平。通过排毒加调养的方式，提升猪群体质。合作企业是一家中等规模的厂家，目前每年约需3～4t左右的大孔树脂，约10万元。按日处理3t柑橘皮渣提取分离柑橘黄酮类化合物计算，总投资约需50万元，经过两年时间目前已收回成本。 该企业有相关技术基础，并发现在大孔树脂的使用量与原料的杂质含量、原料的预处理程度、使用方法有很大的关系，目前根据方案已采用超临界CO2萃取技术、膜分离、柱层析技术等方法来实现提取。 这三种方法各有千秋，超临界CO2萃取技术的优点是没有溶剂残留，生产效率高，但是，超临界CO2萃取技术适用范围窄，可应用于脂溶性成分的提取，对于极性大分子的物质提取率低。膜分离能保持被提取成分的生理活性，能耗低，选择性较强，但存在膜的清洗困难的问题，清洗膜所用的时间往往是进行膜分离所用时间的几倍以上，生产周期较长，增加了生产成本。柱层析可根据生产需要选择适当的吸附剂来完成离子交换、凝胶等多种提取、分离、纯化等单元操作，适用范围广，尤其在活性成分的提纯方面，有较大的优势。 黄酮类化合物存在于花、叶、果等植物组织中，一般以苷的形式存在，而在木质部坚硬组织中多以游离配基形式存在。黄酮苷类以及极性稍大的配基（如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查尔酮等），一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。其中用的最多是甲醇水或甲醇，一些多糖苷类可以用沸水提取，为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解，也常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性。对得到的粗提取物可进行精制处理，常用的方法有溶剂萃取法、碱提酸沉法、炭粉吸附法、离子交换法等。 橙皮苷是橙皮中的黄酮类化合物，不仅具有抗氧化作用，还具有防霉抑菌作用，特别适合于作酸性食品的防霉剂，同时还是一种功能成分，具有止咳平喘、降低胆固醇和血管脆性、抗衰老等功效，可用于生产保健食品。橙皮苷具有酚羟基，呈弱酸性，可采用碱提酸沉的方法提取，下面简单介绍一下橙皮苷的热水提取和碱提取的工艺技术。

1．热水提取工艺 热水法提取的工艺为： 柑橘皮渣→粉碎→压榨过滤→滤液真空浓缩→低温静置→结晶析出类黄酮→过滤分离→类黄酮粗品→用热水或酒精纯化→类黄酮纯品

2．碱提酸沉工艺 工艺流程 柑橘果皮→压榨过滤→加热→保温→冷却沉淀→收集黄色沉淀物→沉淀溶解→重结晶→离心脱水→干燥→粉碎→精制橙皮苷

（五）黄酮类化合物的柱层析分离技术

黄酮类化合物的分离工艺，主要依据以下特性：①极性大小不同，利用吸附或分配原理进行分离；②酸性强弱不同，利用梯度pH值萃取法进行分离；③分子大小不同，利用葡聚糖凝胶分子筛进行分离；④分子中某些特殊结构，利用金属盐络合能力不同等特点进行分离。有机溶剂提取法虽是目前普遍采用的提取分离方法，但存在着生产工艺复杂，生产周期长，对热敏性成分破坏大，提取率低，溶剂残留严重等缺点。而离子交换柱法，又叫柱层析法能克服有机溶剂法缺点，显示了越来越好的发展前景。 工艺流程及技术要点 1．柱层析分离黄酮工艺流程 柑橘类果皮和皮渣→热水浸提→滤液→提取液 ↓装柱 大孔吸附树脂→前处理→装柱→树脂柱→水洗去杂质→洗脱→ 浓缩干燥→柑橘黄酮精制产品 2．柱层析分离黄酮的技术要点（略）