[00964654]耐高温β-葡萄糖苷酸酶基因及其获得方法

体外定向分子进化是人为快速改变基因的结构，产生新蛋白质和新表型的重要分子生物学方法。近年来，DNA改组(DNAshuffling)技术作为一种新的方法，使体外定向分子进化在实验室中产生新的突变分子。DNA改组最常规的应用是产生诸如改变底物特异性，提高酶学特性和扩大应用范围等的酶。已经在工业催化用酶，作物性状改良，医药应用等方法得到具体的应用。大肠杆菌的β-葡萄糖苷酸酶基因，是一个使用广泛的报告基因。由于其具有检测灵敏，酶性质稳定，完善的酶学分析方法和可见的表型等特点，已经成为研究体外分子进化技术的一个好的模式。该成果建立了一个高通量β-葡萄糖苷酸酶基因的体外分子进化体系，并通过该高通量体系获得了一个较野生型显著耐受高温的突变体：GUS-TR。该突变体的大肠杆菌转化子在膜上能够耐受100℃的高温达30分钟，而对照不能耐受70℃的高温。通过6-His表达和镍离子螯合层析得到纯化的突变体和野生型蛋白GUS-TR和GUS-WT。酶活性测定结果显示，经过70℃处理10分钟，表达的野生型的GUS-WT活性明显下降，而表达的耐高温的GUS-TR，经过80度加热30分钟，活性依然保留在50%以上。