[00852760]猪禽流感疫苗大规模生产及诊断关键技术

本项目属于农业科学中的动物传染病防制领域。随着养殖业发展，养殖集约化程度提高，猪流感和禽流感的发生和流行亦变得日益复杂，给养殖业带来巨大威胁。猪流感病毒和禽流感病毒可以成为人流感新病毒的基因来源，禽流感病毒还可以直接感染人，因此，防制猪禽流感还有重要的公共卫生学意义。快速特异的诊断技术、标准化的诊断试剂和安全高效的疫苗是防制猪禽流感的关键，本项目在国内首次采用细胞悬浮培养技术生产禽流感疫苗（细胞株），同时研制了禽流感和猪流感鸡胚苗，建立了猪流感病原学和分子生物学诊断技术，并对临床上猪流感的流行情况开展了血清学调查，取得的新成果有：1．首次对MDCK细胞进行改造，增加了唾液酸半乳糖α2，3受体丰度，建立了稳定的传代细胞株（MDCK-α2，3株），使其更好的适应禽流感病毒的增殖，提高了抗原效价。2．首次将新型聚酯纤维纸片载体应用到激流式灌注多功能生物反应器产业化生产MDCK-α2，3株细胞，获得2.6×10<'6>个细胞/mL、650L/次大规模生产MDCK-α2，3株细胞技术；将微载体应用到多功能生物反应器中大规模生产MDCK-α2，3株细胞技术，获得3.5～3.8×10<'6>个细胞/ml 、130L大规模生产MDCK-α2，3株细胞技术，突破制约细胞大规模生产的关键瓶颈技术。3．首次采用新型聚酯纤维纸片载体的激流式灌注生物反应器650L和微载体的生物反应器130L的生产体系大规模生产MDCK-α2，3株细胞，接种禽流感病毒（H5N1），培养病毒血凝价达到1:2048。开发出环境友好型病毒大规模生产工艺，可以减少传统鸡胚培养病毒造成的散毒和污染环境的危险，具有显著的经济效益和生物安全性好的特点。4．利用悬浮培养大规模生产禽流感病毒技术培养病毒，制备灭活疫苗，用细胞培养的抗原纯净度高，免疫抗体水平提升较快，比常规的鸡胚疫苗抗体水平提前一周达到最高水平，并且免疫应激小，获得了新兽药注册证书（2012新兽药证字15号）。5、研制了禽流感H5、H9二价苗和新支流三联苗，制备了禽流感血凝及血凝抑制试验抗原及阴、阳性标准血清，并获得新兽药证书（2005新兽药证字28号、2009新兽药证字27号）。研制了猪流感灭活疫苗（SSD株）。6、在国内首次报道猪流感病毒H1和H3亚型核酸探针的制备和应用。建立了猪流感病毒通用型及H1/ H3特异性核酸检测方法。对我国部分养猪场猪流感进行了血清学调查，并对猪流感病原进行了分离鉴定，分离出2株H1型、1株H3型猪流感病毒。7、建立了猪流感病毒通用型RT-PCR方法，H1/ H3特异性RT-PCR方法，可用于临床上猪流感病毒的检测。制定了可以动物流感检测A型H1N1流感病毒HA、NA焦磷酸测序检测方法中华人民共和国国家标准。青岛农业大学被批准成为国家猪流感定点检测实验室。8、通过分子克隆技术，对动物流感病毒分离株HA、NA、M等基因的部分序列进行了克隆和测序，获得了当前流行毒株的基因信息。本项目共获得诊断试剂及疫苗产品4个（新兽药证书），制定国家标准1项，申请发明专利4项，发表论文25篇，推广应用获经济效益1.6亿元。项目主要成果经专家鉴定委员会鉴定，认为达到国际领先水平。