[00699280]海洋生物药用功能基因的研究与开发

为了解决基因工程药物的源头创新问题，提高中国海洋生物功能基因组学的研究水平，该课题采用高效功能表达克隆、生物信息学、规模化功能筛选和大规模测序等前沿技术，开展了药用海洋生物功能基因的研究，并取得了重要进展。该课题于2001年正式启动，于2003年获得滚动支持，并于2005年11月通过了科技部组织的课题验收。该课题通过研究形成以下成果：重要海洋药用生物资源基因库及基因数据库的建立：为了获得海洋生物药用功能基因，并永久保存珍贵的海洋生物基因资源，该成果运用现代分子生物学技术，建立了32个高质量南海海洋生物及组织的eDNA文库，每个文库的克隆数至少达到10<'5>个，保存了大量珍贵的海洋生物基因资源。对来源于18种海洋生物共24个eDNA文库进行了大规模测序，共获得原始核苷酸序列45435条，涉及到日本鬼鲉、居氏鬼鲉、玫瑰毒鲉、金钱鱼、文昌鱼、海马、水母、赤魟、海葵、海兔、青环海蛇、平颏海蛇、淡灰海蛇等海洋生物。通过对EST数据的整理分析，建立了具有中国特色、功能较完善、查询方便和界面清晰的海洋生物功能基因数据库。同时，下载并收录了酵母、河豚等6种模式生物的蛋白质序列共137024条，供海洋生物药用功能基因的生物信息学、比较基因组学等研究。该数据库的建立为海洋生物功能基因研究提供了一个平台。海洋生物特有功能基因的高效表达系统及应用：通过建立南海海洋生物cDNA文库及EST序列测定和生物信息学分析，课题组获得多个海洋生物特有的新的毒素及具有特定生理活性的多肽编码基因。海洋生物活性肽分子小、具有多对二硫键等特点增加了重组表达的难度。该成果设计一种融合蛋白表达载体pTRX，使融合伴体TRX与外源基因融合，在原核细胞中表达融合蛋白，表达量高而稳定，其6His标签简化了纯化步骤，提高了重组蛋白的纯度，特异性肠激酶切割位点，使重组蛋白氨基酸序列与天然蛋白完全一致。应用该载体对所获新基因成功进行高效活性表达。重组表达产物平颏海蛇短链和长链神经毒素具有明显的镇痛作用，碱性磷脂酶A2对肿瘤细胞具有明显的抑制和毒性，水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶具有明显的竞争性抑制作用，具有潜在的抗虫、抗菌、抗病毒及肿瘤迁移抑制作用，海葵溶细胞素具有抗肿瘤活性。有关重组蛋白已由相应的公司投资进行深入研究和药物开发，在知识产权转让方面获得了一定的经济效益。海洋生物潜在药用功能基因的功能研究：利用生物信息学技术和快速功能基因筛选，课题组初步确定并克隆了97个有应用前景的海洋生物功能基因。对其中18个潜在药用功能基因进行了比较深入的研究，完成了海葵强心肽、海葵细胞毒素、水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂、海蛇神经毒素、赤缸肿瘤抑制因子等药用功能基因在大肠杆菌或酵母中的表达和纯化工艺。完成了海葵强心肽、海葵细胞毒素、海蛇神经毒素的理化性质、生理功能和初步药效学研究。实验结果表明，海葵强心肽能明显增加离体心房的收缩作用，在小动物和大动物的活性检测模型上均具有良好的效果；海葵细胞毒素对小鼠移植性肝癌具有明显抑制作用。由北京博奥环宇生物技术有限公司出资，成立了中大博奥环宇生物技术联合实验室，对该研究成果中的3个海洋生物新基因进行产业化开发。该成果为进一步的产业化研究并由此开发出具有中国自主知识产权的重组海洋肽类新药和功能蛋白奠定了良好的基础。该课题国内发表论著6篇、国外18篇；申请发明专利25项(其中国外4项)、获得发明专利授权7项；获得教育部提名国家科学技术奖技术发明奖一等奖1项；培养博士后4名、博士15名、硕士20名；成果转让2项、转让收入500万元。