[00659952]抗鸡马立克氏病双价基因工程冻干疫苗中试

鸡马立克氏病(MD)是鸡的一种常见的淋巴组织增生性肿瘤疾病，因可引起高死亡率、胴体废弃增加、饲料报酬低和严重免疫抑制，造成的经济损失十分巨大，是中国最重要的禽病之一。MD的防控除采用严格的生物安全措施防止早期感染外，接种疫苗是最有效的策略。目前中国使用量较大的MD疫苗CVI988，虽然比早期的火鸡疱疹病毒疫苗(HVT)保护力强，但由于它必须在液氮中保存和运输，而且价格偏高，不能满足中国养禽业以中小型为主、肉鸡使用MD疫苗上升的市场需要。为此课题组以鸡痘病毒中国疫苗株(282E4)为载体分别构建了表达MDV gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-MDgB)和表达II型干扰素(IFN II)的重组鸡痘病毒(rFPV-IFN II)，将它们的冻干制剂与鸡MD火鸡疱疹病毒(HVT)冻干制剂组合成联苗。为了解决该疫苗工业化生产和大面积推广应用中的问题，课题组承担了农业科技成果转化资金项目《抗鸡马立克氏病双价基因工程冻干疫苗中试》(02EFN213201078)，通过两年多的努力，该项目在技术上取得了突破，推广转化取得成就，产生了良好的经济、生态和社会效益。一、技术突破：对任何动物用疫苗来说，特别是基因工程疫苗，有3个特性决定它是否有工业化生产和推广应用价值，这就是安全性、免疫效力和价格。课题组在该项目的实施过程中，集中力量解决与上述3个方面有关的技术问题，取得了突破。1.提高了重组鸡痘病毒对1日龄雏鸡安全性：经过基因操作，获得的重组rFPVs比其母本病毒282E4对1日龄雏鸡安全，以10倍疫苗剂量免疫在观察期内全部健活，而且无全身痘反应，与此相反母本病毒282E4在用作疫苗时只能用于2周龄以上的鸡，2周龄以下的雏鸡会产生包括死亡在内的严重副反应。通过农业转基因安全评价中间试验、环境释放试验和生产性试验，重组鸡痘病毒rFPV-MDgB和rFPV-IFN II已取得生产应用安全证书(2004-2009年)。综上所述，以鸡痘病毒为载体的抗鸡马立克氏病双价基因工程疫苗是很安全的。2.克服母源抗体干扰，提高了重组疫苗的免疫效力：以鸡痘病毒为载体的基因工程疫苗研究在国内外已有十多年的历史，但是到目前为止大规模投入推广应用的很少见，究其原因是因为母源抗体对重组疫苗有严重的干扰作用，影响其免疫效力。为了解决这一难题，课题组研究了用不同途径克服母源抗体干扰的方法，其中包括筛选合适的细胞因子作为免疫佐剂，表达外源基因的插入载体优化和启动子优化和外源基因的表达方式。研究中发现，分别表达两种鸡细胞因子的rFPV与表达保护性抗原基因的rFPV以一定比例的量混和后免疫鸡，不仅有强的抗母源抗体干扰作用，而且显著减轻重组鸡痘病毒接种幼龄雏鸡产生的增重减缓和免疫抑制等副作用。根据该发现申请的发明专利《重组鸡痘病毒联合疫苗》正在进行实质审查。研究中还发现插入载体的优化和启动子优化对抗母源抗体干扰也起关键作用。用优化的插入载体和启动子构建的表达保护抗原的rFPV进行免疫保护试验，证明其抗母源抗体性能可达到现场应用可接受的程度。3.优化了重组鸡痘病毒工业化生产的工艺：在新工艺条件下细胞和病毒产量大幅度提高，降低了重组鸡痘病毒的生产成本，使该基因工程产品在价格上具有与常规疫苗竞争的优势。单胚细胞产量从6×10<'7>个左右上升到2.0-2.5×10<'8>个，每个中转瓶(3000ml容量)接种最适量的细胞和病毒，可生产4×10<'10>PFU的重组鸡痘病毒，产量远高于用鸡胚或细胞生产的常规鸡痘疫苗。这种优化工艺使以鸡痘病毒为载体的MD双价基因工程疫苗和其他基因工程疫苗在与常规疫苗或其他载体基因工程疫苗的竞争中处于很有利的地位，加之该疫苗具有不需液氮保存、运输使用方便的特点，因此市场前景很好。二、推广转化及经济、生态及社会效益：该成果完成了区域试验和扩大区域试验近500万羽份，从试验地区反映的情况来看，该抗鸡马立克氏病双价基因工程冻干疫苗，不需液氮保存，运输、使用方便，免疫效力达到MD 1型冷冻疫苗CVI988/Rispens和2+3型冷冻疫苗的相同水平，而价格只需两种冷冻疫苗的一半，受到广大用户特别是中小型养禽企业的欢迎，取得了良好的经济、生态和社会效益。该项目的实施有利于农业结构调整，对农村养殖业特别是中小型养鸡业的发展起到良好的促进作用，而养鸡业的发展是部分地区农民增收的主要途径。该项目在执行期内生产疫苗累计约1亿羽份，产值500万元，利税300多万元。