[01827546]Mechanism of herbal pairs with the properties of Qi-tonifying, blood activation, blood-stasis breaking in treating coronary heart disease

1.过氧化氢造模下细胞光镜下形态学比较 青年组细胞连接较紧密,细胞形态呈铺路石样,细胞核呈圆形或椭圆形,可见到1-2个核仁,胞浆丰富。H2O2组造模后,细胞生长速度放慢,胞质内出现空泡,胞浆内颗粒增加,甚至变浑浊,胞核明显,出现多核,排列变稀疏,贴壁能力下降,甚至部分细胞脱落。中药各剂量组与Resv组较H2O2组与DMSO组细胞空泡出现变少,胞浆内颗粒较少,细胞贴壁能力尚可。 2.过氧化氢造模下透射电镜细胞自噬超微结构 青年组细胞结构完整,细胞核形态正常,核内染色质均匀无颗粒,核膜完整光滑,各种细胞器丰富且形态完整,可见少量溶酶体;H2O2与DMSO组形态不规则,细胞膜破损,核仁成颗粒状散裂,染色质不显,胞质内出现大量双层膜结构的自噬小体及自噬空泡,次级溶酶体数量增多。与H2O2组比较 ,中药各组细胞核膜相对完整光滑,胞质中产生大量的自噬体、自噬空泡及次级溶酶体;Resv组细胞自噬现象明显,双层膜结构的自噬体数量增多。 3.过氧化氢造模下细胞SA-?-gal阳性染色比较 青年组细胞染色在25%作用,H2O2细胞约占89%,DMSO细胞染色已约占85%,中药高剂量组细胞已约占67%左右,中药中剂量组细胞已约占60%左右,中药低剂量组细胞已约占65%左右,Resv组细胞已约占61%左右。 4. 过氧化氢造模下线粒体膜电位荧光强度测定 与青年组比较,H2O2组线粒体膜电位荧光强度明显下降,具有显著性差异（P＜0.05）;与模型组比较,中药中、高剂量组及Resv组线粒体膜电位荧光强度增高,具有显著性差异（P＜0.05）。H2O2组与DMSO组线粒体膜电位荧光强度差异无统计学意义。 5. 荧光显微镜下发现,青年组细胞内线粒体ROS荧光强度较弱,仅有少数细胞可以观察到荧光信号,说明线粒体内ROS含量较低;H2O2模型组与DMSO组荧光强度最高,大量细胞可见明亮的红色荧光信号,细胞边缘较清晰,胞质明显,这说明线粒体内ROS含量较高;中药高中低剂量组与Resv组细胞红色荧光强度比复制性衰老组明显偏弱,比青年组细胞荧光强度明显增加,说明用药组细胞内线粒体ROS含量介于两者之间。 6.蛋白表达研究：在SIRT1蛋白的表达中,与青年组相比,模型组SIRT1含量明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,中药中剂量组、白藜芦醇组、中药中剂量组+EX527组蛋白表达明显增多,具有显著性差异（P＜0.05）。 在MnSOD蛋白表达中,与青年组相比,模型组MnSOD含量明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,中药高、中、低剂量组与白藜芦醇组表达明显增多,具有显著性差异（P＜0.05）。 在LC3A/B蛋白表达中,与青年组相比,模型组LC3A/B含量明显增高,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,中药高、中、低剂量组与白藜芦醇组表达明显降低,具有显著性差异（P＜0.05）。 在P66蛋白表达中,与青年组相比,模型组LC3A/B含量明显增高,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,中药中、低剂量组与白藜芦醇组表达明显降低,具有显著性差异（P＜0.05）。 7. 与青年组比较,H2O2组G0/G1期细胞数量明显增多, G2/M期细胞比例增加数量减少,具有显著性差异（P＜0.05）;与模型组比较,中药低、中、高剂量组及Resv组G0/G1期细胞数量明显减少,具有显著性差异（P＜0.05）;中药高剂量组、Resv组在G2/M期细胞数量明显增加,具有显著性差异（P＜0.05）。H2O2组与DMSO组在G0/G1期、S期、 G2/M期差异均无统计学意义。 实施过程及结果：实验过程中,根据内皮细胞造模及中药干预情况,在保障实验指标不变的前提下,对部分实验技术方法做了手段上的优化。 解决的关键科学问题：本项目从血管衰老的关键环节之一内皮细胞入手,以SIRT1-自噬通路为切入点,探讨了人参三七川芎提取物延缓血管内皮细胞衰老的机制,发现人参三七川芎提取物可能通过对以SIRT1-自噬通路的调节,最终达到延缓过氧化氢诱导的内皮细胞衰老的作用。