[01544200]重要海域致病性细菌基因芯片检测技术研究开发与示范

1、项目概况 “重要海域致病性细菌基因芯片检测技术研究开发与示范”（201105007）,是2011年获批的国家海洋公益性行业科研专项经费资助项目,总投资887万元。宁波大学为主持单位,国家海洋局第一海洋研究所、大连海洋大学、国家海洋环境监测中心、国家海洋局北海环境监测中心、复旦大学、上海海洋大学和浙江万里学院为参加单位。 项目选择重点增养殖区、重要海水浴场、典型排污口和著名港口航道,研究其人畜共患的致病性细菌的种类、生理生化特性和遗传信息,建立一套鉴别致病菌的特征谱库,筛选检测靶基因和相关蛋白,设计并合成探针,构建致病菌的高通量、快速、准确的微阵列基因芯片检测平台;项目同时研发海水中大肠杆菌的计数、具有暴发性传染力的霍乱弧菌的富集、记数及分型技术,构建微流控基因芯片检测致病菌的监控平台;在此基础上,起草检测技术规程和标准,开展示范性应用和业务化推广,并提供在线咨询和培训等多种形式的技术服务。 2、成果及应用 2.1 项目目前取得的成果 （1）中试生产线1条—微阵列基因芯片生产线（生物芯片国家工程研究中心宁波分中心）; （2）中试基地1个—生物芯片国家工程研究中心宁波分中心,产业化示范基地1个（浙江正力安拓生物科技有限公司）; （3）业务化平台：致病性细菌微阵列基因芯片设计和加工技术平台;微流控基因芯片设计和加工技术平台;重点海水浴场业务化监测平台;船载海上基因芯片检测平台。 （4）新工艺：9种致病性细菌的免疫磁珠制备工艺;多组学设计探针的工艺;致病性细菌荧光和非荧光微阵列基因芯片的生产新工艺;基于水凝胶的微流控基因芯片封装新工艺;细菌裂解微流控芯片加工工艺;基于微流控芯片非接触电导检测的海水中致病性细菌分型和记数装置加工工艺。 （5）新产品：9种海洋致病性细菌的免疫磁珠;10款荧光标记微阵列基因芯片,1种非荧光标记微阵列基因芯片和4个试剂盒,1个海上芯片实验室; （6）新装置：1款便携式基因芯片检测设备;基于CMOS成像元件和非接触电导的霍乱弧菌的分型和大肠杆菌记数装置。 （7）新技术：磁珠的化学修饰技术;光引发法和氧化还原引发的表面原位聚合成形技术,恒温陶瓷热压成形技术,水凝胶模具表面原位聚合技术。 2.2 技术培训及业务化应用 2010年底,课题组成员,在生物芯片国家工程研究中心宁波分中心举办了为期7天的生物芯片前沿技术研讨、技能培训和产品研发的培训,共有34人参加并获得结业证书。 2015年课题组在青岛举办了业务化培训班,来自“山东省海洋环境监测中心、农业部渔业质检中心（天津）、葫芦岛市海洋与渔业环境监测中心站、大连海洋环境监测中心站、烟台海洋环境监测中心站、日照海洋环境监测中心站、河北省海洋环境监测中心、唐山海洋环境监测预报中心”的20余位海洋环境监测行业一线人员参加了培训。通过相关理论学习、观看录像和实际动手操作的实践,学员们掌握了基因芯片检测致病性细菌的操作步骤,也验证了芯片的灵敏度和准确性。同时收到了6份基因芯片验证和评价报告,20份应用报告。 2.3 成果的产业化情况 “重要海域致病菌检测基因芯片”项目成果,现已在“浙江正力安拓生物科技有限公司”进行转化,获批了2014年海洋经济创新发展区域示范专项资金资助项目—海洋致病菌检测基因芯片产业化关键技术研究与示范,2016年7月项目已经通过专家验收。目前公司投入资金7000余万元,购入设备120余台/套。建成了功能海区致病性细菌荧光/非荧光标记微阵列检测基因芯片的加工生产线,试剂盒生产线、检测器生产线。起草的行业标准也获得国家海洋局的立项（HY/T,20161220-T）,7项专利已经进行技术转让。病原微生物的智能化检测平台参与申报了国家十三五重点研发项目,病原微生物检测试剂盒也申报了宁波市十三五的创新服务平台。 多功能杂交盒已经在“宁波安芯生物科技有限公司”进行了成果转化,产品正在销售。掌上生物芯片实验室参加了第二届中国“互联网+”创新创业大赛浙江省金奖,国家银奖。 3、项目创新点 3.1、高通量技术应用于致病菌生物信息分析 利用高通量测序技术对沿海环境的细菌多样性进行了研究;运用454焦磷酸测序技术分析了经济海水养殖品种的致病菌信息;采用Illimina HiSeq 2000测序技术获得致病菌基因组序列。利用iTRAQ、DIGE和2D-E技术,从多种致病菌中鉴定出大量和致病相关的差异蛋白和差异基因,探索出了环境与致病相关的信号通路。 3.2、功能海域致病菌的分离与鉴定 从重点增养殖区、海水浴场、港口航道、典型排污口四类功能海域,共分离纯化致病性细菌2800余株菌,鉴定出300余株致病性细菌。利用16S rRNA测序、API和Biolog等技术鉴定出增养殖区的耐药菌株、海水浴场的陆源和土著的病原微生物、陆源排污口的指示性病原微生物、港口航道的外来入侵病原体。 3.3、微阵列基因芯片的设计和加工与示范应用平台 平台包括基于化学、物理和生物学为一体的基片前处理技术;基于多种技术筛选致病性细菌的特异性探针;基于磁性纳米材料的致病性细菌富集技术;基于多学科技术的便携式检测设备和智能化软件;基于多种技术与微阵列检测基因芯片的应用示范。 3.4、微流控基因芯片的设计、加工与示范应用平台 平台包括微流控芯片的设计和加工设备,开发出由CAD软件、电脑、激光切割机、超声清洗机、匀胶机、钻床、紫外光照射系统和热压封装系统构成微流控基因芯片的快速加工平台和微流控基因芯片加工技术。 3.5、船载/车载海上芯片实验室 将基因芯片、富集致病性细菌的免疫磁珠、扩增液和标记杂交液等试剂盒、扩增仪、基因芯片检测设备、分析识别软件等集成在一个多功能的箱子里面。这样可随船/车检测,并且可以在短时间内将报告上传岸基,对于预警预报意义非常重大,该技术在国内外未见报道。 3.6、网络平台 利用网络管理平台,解决异地多单位的全方位的管理。极大地提高了项目管理的效率,同时增加了项目组内部的沟通、交流,并提供了有效的宣传平台。2012年在海洋局系统作了经验介绍,该成平台2013年7月通过专家验收。