[01407451]抗多发性骨髓瘤新型纳米疫苗的研发

目的 以类脂囊泡及脂质体纳米递送系统构建抗多发性骨髓瘤疫苗多肽MART-1aa26-35*A27L 为基础的新型纳米疫苗并对其进行功效评价,同时探索可提升纳米疫苗功效的免疫佐剂联和应用,为本研究构建的新型抗骨髓瘤纳米疫 苗 应 用 潜 力 及 前 景 提 供 依 据 。 方 法 通 过 薄 膜 分 散 法 制 备MART-1aa26-35*A27L 脂 质 体 纳 米 疫 苗 （ LP-MART-1aa26-35*A27L ） 和MART-1aa26-35*A27L 类脂囊泡纳米疫苗（NS-MART-1aa26-35*A27L）,优化制备工艺,表征两者药剂学参数;并进行功能评估,以纳米疫苗体外处理人外周血单个核细胞诱导而成的树突状细胞（Dendritic cell,DC）、其后刺激自体特异性T 细胞活化增殖,此过程中流式细胞学检测 DC 表面成熟相关分子的表达,EliSpot 法检测活化特异性 T 细胞的数量,ELISA 法检测活化 T 细胞细胞毒性物质 Granzyme B 的分泌水平。此外,从供者外周血中分离出单个核细胞,并体外培养、诱导形成 DCs。此过程由 DC I 培养基中培养 7 天,以及随后 DC II 培养基中培养 3 天完成,其中后 3 天予以达沙替尼处理或设对照组。 第 10 天收获细胞并用流式细胞术分析 DC 成熟相关标志物分子的表达。设门总细胞中CD80+CD86+细胞群作为DCs,随后分别分析这一细胞群中 CD83,CD40或HLA-DR的表达。结果 （1）本研究通过薄膜分散法制备了 MART-1aa26-35*A27L-LP,并通过正交试验优化了 MART-1aa26-35*A27L-LP的制备处方和工艺。结果显示,MART-1aa26-35*A27L-LP 的最优制备处方和工艺是磷脂终浓度为 10μg/mL、磷脂与胆固醇质量比为 6:1、多肽终浓度为 1mg/mL 以及水合时间为 30min。（2）本研究通过 RP-HLPC 建立了 MART-1aa26-35*A27L 的体外分析方法,并通过 粒 径 分 析 仪 和 透 射 电 镜 对 制 备 的 MART-1aa26-35*A27L-LP 和MART-1aa26-35*A27L-NS 进行了表征。结果显示,MART-1aa26-35*A27L-LP 和MART-1aa26-35*A27L-NS 的平均包封率分别为 49.4%、52.89%,平均载药量分别为 4.06%、6.22%,平均粒径分别为 192.4nm、207.50nm,平均 Zeta 电位分别为-9.41mv、-12.50mv,平均 PDI 分别为 0.27、0.15。（3）本研究通过体外人源 细 胞 实验 检测 了 MART-1aa26-35*A27L-LP、 MART-1aa26-35*A27L-NS 和MART-1aa26-35*A27L-PBS 等 诱 导 的 CTL 免 疫 应 答 。 结 果 显 示 ,MART-1aa26-35*A27L-LP 和 MART-1aa26-35*A27L-NS 均能显著促进 CD80 在 DC表面的表达,并能显著提高 CD56-CD8+CTLs 数目,且这些 CD56-CD8+CTLs 会产生大量的 granzyme B。（4）LP-MART-1aa26-35*A27L 诱导的 CTL 免疫应答效果显著优于 PBS-MART-1aa26-35*A27L,NS-MART-1aa26-35*A27L 诱导的 CTL 免疫应答效果优于 PBS-MART-1aa26-35*A27L,且 LP-MART-1aa26-35*A27L 诱导的 CTL免疫应答效果显著优于 NS-MART-1aa26-35*A27L。（5）CD80+CD86+细胞群占总细胞的比例在健康供者组和患者组之间没有统计学差异（89.46%±9.70% vs87.39%±9.34%,P=0.690）。当分析 10 例健康供者来源的 DCs,与对照组相比,达沙替尼显著增加了 DCs 上 CD40（P=0.008）和 HLA-DR（P=0.044）的表达比例。DCs 上 CD83 的表达比例在达沙替尼组和对照组之间无统计学显著性差异（P=0.233）。当分析 10 例患者来源的 DCs,与对照组相比,达沙替尼显著增加了 DCs 上 CD40（P=0.023）,CD83（P=0.038）和 HLA-DR（P=0.001）的表达比例。结论 将 MART-1aa26-35*A27L 包载于脂质体和类 脂囊泡中能促使MART-1aa26-35*A27L 诱 导 出 更 强 的 CTL 免 疫 应 答 效 果 , 且 将MART-1aa26-35*A27L 包载入脂质体纳米粒中诱导出的免疫应答效果更佳,同时,本研究首次报道达沙替尼可在体外显著地促进 DCs 的成熟,其有潜力作为佐剂联合应用与纳米疫苗中以提升疫苗功效。本研究中纳米疫苗显示出一定抗多发性骨髓瘤应用潜力与前景。