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[01395495]高催化性能腈水合酶的开发与产业化应用

交易价格: 面议

所属行业: 调味及发酵

类型: 非专利

交易方式: 资料待完善

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服务承诺
产权明晰
资料保密
对所交付的所有资料进行保密
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技术详细介绍

腈水合酶是一类可以催化腈类物质转化为相应的酰胺类化合物的金属酶,工业上利用其催化丙烯腈转化为丙烯酰胺。目前使用的菌株是1991年开发的含有腈水合酶的红球菌J1。由于腈水合酶热稳定性不高、对产物的耐受性差,且红球菌J1培养条件要求高,培养时间长,因此生物法比化学法的优势越来越不明显,已经成为是当前生物法生产丙烯酰胺的瓶颈。在国家以及省部级科技计划的资助下,本课题组对腈水合酶生物合成机制、分子结构等进行系统研究,发现了影响腈水合酶活性与稳定性的关键因素及影响底物选择性的关键位点。在此基础上,通过蛋白质工程技术提升腈水合酶催化性能及底物选择性,开发出了新一代具有高催化性能的基因工程菌,开发了烟酰胺的生物法制备工艺及其他酰胺类物质的制备技术。主要技术内容如下: (1)解析钴型腈水合酶生物合成机制及分子结构特点,为酶分子改造提供理论支撑。对钴型腈水合酶的理化性质、生物合成机制、翻译后的成熟机制进行研究,发现一种全新的蛋白质翻译后活性化体系,命名为亚基自身交换机制,且证明亚基自身交换机制在不同来源的钴型腈水合酶生物合成中具有普遍性;同时发现对腈水合酶的活性与稳定性起关键作用的蛋白,命名为亚基自身交换伴随子(又称调控亚基),结构解析显示其C-domain高度柔性带正电的结构协助腈水合酶成熟;利用生物信息学以及分子对接解析腈水合酶催化腈类底物机理,发现腈水合酶催化二腈类底物的区域选择性关键氨基酸位点及催化外消旋腈类底物的立体选择性的关键氨基酸位点。 (2)通过蛋白质工程技术改造提升腈水合酶催化性能。利用蛋白质杂化融合技术构建由不同来源腈水合酶的结构域片段拼接组合而成的杂合酶,该酶具有更强的热稳定性,且活性不受影响;构建了亚基融合的新型单链腈水合酶,该酶比酶活、热稳定性分别提高30%和50%,展现出优良的催化特性;利用分子信息学、定向进化和定点突变等手段,成功调控了腈水合酶催化二腈类底物的区域选择性、以及催化外消旋扁桃腈的立体选择性,可实现多种酰胺类物质的生物转化。 (3)构建出高效表达腈水合酶的重组基因工程菌。基于获取的优势催化性能的腈水合酶及表达条件优化,构建了高催化性能的基因工程菌。该基因工程菌全面优于目前使用的野生菌株,实现了丙烯酰胺生产菌株的更新换代。同时建立了烟酰胺的生物法制备工艺,实现了烟酰胺的绿色生产。 项目的主要技术性能指标:酶活和稳定性分别为30%、50%;基因工程菌细胞酶活达到4000 U/mL,是目前使用的野生菌J1菌的1.8倍;发酵时间48小时,是J1菌的50%;产品浓度达40%,比J1菌提高10%。本项目发表相关SCI论文20篇;获得授权中国发明专利7件、美国发明专利2件。 本项目技术成果已经在江苏昌九农科化工有限公司(国内生产丙烯酰胺最大企业)实现产业化,降低生产成本20%,提高生产效率30%,三年累计销售额达10亿元,新增利润8004万元,丙烯酰胺产品市场占有率达到38.6%。另外在山东金洋药业有限公司实现了烟酰胺的生物法制备,已投入生产。
腈水合酶是一类可以催化腈类物质转化为相应的酰胺类化合物的金属酶,工业上利用其催化丙烯腈转化为丙烯酰胺。目前使用的菌株是1991年开发的含有腈水合酶的红球菌J1。由于腈水合酶热稳定性不高、对产物的耐受性差,且红球菌J1培养条件要求高,培养时间长,因此生物法比化学法的优势越来越不明显,已经成为是当前生物法生产丙烯酰胺的瓶颈。在国家以及省部级科技计划的资助下,本课题组对腈水合酶生物合成机制、分子结构等进行系统研究,发现了影响腈水合酶活性与稳定性的关键因素及影响底物选择性的关键位点。在此基础上,通过蛋白质工程技术提升腈水合酶催化性能及底物选择性,开发出了新一代具有高催化性能的基因工程菌,开发了烟酰胺的生物法制备工艺及其他酰胺类物质的制备技术。主要技术内容如下: (1)解析钴型腈水合酶生物合成机制及分子结构特点,为酶分子改造提供理论支撑。对钴型腈水合酶的理化性质、生物合成机制、翻译后的成熟机制进行研究,发现一种全新的蛋白质翻译后活性化体系,命名为亚基自身交换机制,且证明亚基自身交换机制在不同来源的钴型腈水合酶生物合成中具有普遍性;同时发现对腈水合酶的活性与稳定性起关键作用的蛋白,命名为亚基自身交换伴随子(又称调控亚基),结构解析显示其C-domain高度柔性带正电的结构协助腈水合酶成熟;利用生物信息学以及分子对接解析腈水合酶催化腈类底物机理,发现腈水合酶催化二腈类底物的区域选择性关键氨基酸位点及催化外消旋腈类底物的立体选择性的关键氨基酸位点。 (2)通过蛋白质工程技术改造提升腈水合酶催化性能。利用蛋白质杂化融合技术构建由不同来源腈水合酶的结构域片段拼接组合而成的杂合酶,该酶具有更强的热稳定性,且活性不受影响;构建了亚基融合的新型单链腈水合酶,该酶比酶活、热稳定性分别提高30%和50%,展现出优良的催化特性;利用分子信息学、定向进化和定点突变等手段,成功调控了腈水合酶催化二腈类底物的区域选择性、以及催化外消旋扁桃腈的立体选择性,可实现多种酰胺类物质的生物转化。 (3)构建出高效表达腈水合酶的重组基因工程菌。基于获取的优势催化性能的腈水合酶及表达条件优化,构建了高催化性能的基因工程菌。该基因工程菌全面优于目前使用的野生菌株,实现了丙烯酰胺生产菌株的更新换代。同时建立了烟酰胺的生物法制备工艺,实现了烟酰胺的绿色生产。 项目的主要技术性能指标:酶活和稳定性分别为30%、50%;基因工程菌细胞酶活达到4000 U/mL,是目前使用的野生菌J1菌的1.8倍;发酵时间48小时,是J1菌的50%;产品浓度达40%,比J1菌提高10%。本项目发表相关SCI论文20篇;获得授权中国发明专利7件、美国发明专利2件。 本项目技术成果已经在江苏昌九农科化工有限公司(国内生产丙烯酰胺最大企业)实现产业化,降低生产成本20%,提高生产效率30%,三年累计销售额达10亿元,新增利润8004万元,丙烯酰胺产品市场占有率达到38.6%。另外在山东金洋药业有限公司实现了烟酰胺的生物法制备,已投入生产。

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