[01385961]具有骨胶原蛋白酶活性的Bacillus cereus MBL13-U的筛选及其酶学特性的研究

本课题是在国家十一五科技支撑项目的基础上展开的。项目组主要针对骨骼加工厂堆积骨骼处采集的土样和水样,进行筛选、诱变选育高产骨胶原蛋白酶的菌株,同时对其所产酶进行分离纯化及其酶学特性的探索与研究。本项目研究的目的、意义及主要内容如下： 胶原蛋白酶（collagenase）是一种经济价值较高的蛋白酶。在工业开发中可应用于胶原蛋白分级降解获得胶原多肽,骨骼中主要的蛋白质为胶原蛋白,由于骨胶原特殊的结构,因此只有为数有限的酶可以引起骨胶原蛋白的降解,研发骨胶原专用的胶原蛋白酶具有极大的潜力。而目前报道的产胶原蛋白酶的微生物大部分来源于致病菌,由于致病菌在产生胶原蛋白酶的同时,会分泌一定的毒素,存在用酶的安全性问题。这些问题均限制了微生物胶原蛋白酶的大规模实际应用,目前能商业化开发作为胶原蛋白酶菌株的出发菌很少。因此,研发出高产、产骨专用胶原蛋白酶的菌株具有重要的理论意义和应用价值。 1.从骨骼加工厂堆积骨骼处所采集的土样中,通过自行设计的筛选模式和复合诱变技术,选育出一株遗传稳定性好,高产骨胶原蛋白酶的菌株B. cereus MBL13-U;为进一步提高菌株产骨胶原蛋白酶的能力,针对菌株发酵产酶条件进行了优化,以酶活为指标,确定了菌株产酶最佳的培养基配方和最佳发酵工艺条件; 2.对B. cereus MBL13-U菌株所产胶原蛋白酶（B. cereus collagenase, BCC）的分离纯化和酶学特性进行了研究。在产酶最佳发酵条件下,从发酵液中分离出分子量为38.0±1.5 kDa的纯化酶BCC。经酶学特性分析表明其富含天冬氨酸、赖氨酸和丝氨酸,BCC是一种金属蛋白酶,对I型胶原蛋白底物具有显著水解性。并探讨了BCC对牛骨胶原蛋白的酶解动力学。实验确定了牛骨胶原蛋白最佳的提取工艺条件为：乙醚低温回流脱脂,0.48 mol/L盐酸脱钙,骨粒径为5 mm×10 mm,提取介质为1%柠檬酸和1%胃蛋白酶复合液;对其结构表征表明所提蛋白为保持完整三股螺旋结构的I型胶原蛋白。然后以水解度（DH）为指标,确定了BCC酶解牛骨胶原蛋白的优化条件为底物浓度30.0 g/mL,温度45℃,0.35% （g/100 mL）的初始酶浓度,pH8.0,酶解时间6 h;并拟合出了酶解动力学方程。 3.通过对细胞固定化条件的研究,根据感官评定和发酵实验,确定出适宜于B. cereus MBL13-U细胞固定化最佳的工艺参数：海藻酸钠浓度为2.0%,氯化钙浓度为1.0%,凝胶时间为5 min（产酶活性最高）。 论文： 1 [1] Lili Liu, Meihu Ma, Zhaoxia Cai, Xieli Yang, Wentao Wang. Purification ＆ properties of a collagenolytic protease produced by Bacillu cereus MBL13 strain. Food Technology and Biotechnology, 2010, 28（2）：151-160. [2] Xu Duan, Guangyue Ren, Lili Liu*, Wenxue Zhu. Salt-induced osmotic stress for lipid overproduction in batch culture of Chlorella vulgaris. African Journal of Biotechnology, 2012, 27（11）：7072-7078. [3] Lili Liu, Meihu Ma, Xieli Yang. Isolation and identification of a novel collagenase-producing strain and study on its enzyme production conditions [D]. Proceeding of the 8th China of Congress of Meat Science and Technology. 2010, 8：103-113. [4] Xu Duan, Li Li Liu, Guang Yue Ren, Wen Xue Zhu. Microwave Freeze Drying of TypeⅠCollagen from Bovine bone, Drying technology, 2013, accepted. [5] 刘丽莉,马美湖,杨协力. 非生物性因素对乳酸链球菌素抗菌活性的影响,食品科学,2009,30（5）：46-49. [6] 刘丽莉,马美湖,余秀芳,王文涛．胶原蛋白酶产生菌的筛选及酶的分离纯化 [J]. 生物工程学报, 2010, 26（2）： 194-200. [7] 刘丽莉,马美湖,杨协力．牛骨I型胶原蛋白提取及结构表征 [J]. 食品科学, 2010, 31（2）： 87～91. [8] 刘丽莉,杨协力,任广跃,段 续. Bacillus cereus胞外胶原蛋白酶水解牛骨胶原蛋白的动力学 [J]. 食品科学, 2012,33（21）：192～195. [9] 刘丽莉,杨协力．产骨胶原蛋白酶菌种的筛选与鉴定 [J]. 食品与生物技术学报, 2011, 30（6）： 917～923. [10] 刘丽莉,马美湖,杨协力．产骨胶原蛋白酶菌的筛选及发酵条件优化的研究[J]．肉类工业, 2009（8）： 34～38. [11] 刘丽莉,杨协力．胶原蛋白酶酶解牛骨胶原蛋白的动力学研究,肉类工业,2011（11）： 21～24. 论著： 1.《食品风味化学》,北京：化学工业出版社,2008,ISBN 978～7～122-01599-0 2.《特种动物产品加工新技术》,北京：中国农业出版社,2012,ISBN 9787109173996 专利： [1] 刘丽莉,任广跃,段续,康怀彬.一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法,2012.12,中国, ZL201110412878.2. [2] 刘丽莉,任广跃,段续,康怀彬.一种低分子量羊骨胶原多肽钙螯合物微胶囊的制备方法,2013.02,中国,ZL201110412900.3.