[01384894]高效甘蔗发酵酒精菌种引进与改造研究

广西为全国最大的蔗糖生产基地,甘蔗种植面积、甘蔗产量和蔗糖产量均约占全国的65%强,每年约产甘蔗糖蜜250万吨。糖蜜是甘蔗制糖的副产物,以其为原料生产酒精一方面可解决广西甘蔗糖业对环境的直接污染,另一方面可变废为宝,显著提高甘蔗制糖副产物的利用价值,极有较高的产业意义。 广西糖蜜酒精产业至今尚存在二大技术问题： （1）发酵水平普遍偏低,成熟醪的酒精浓度只有9～10%（V/V,夏天）和10～11%（V/V,冬天）,发酵效率仅占理论值90%左右,生产每吨酒精约需要4.5吨糖蜜,导致生产原材料单耗、成本、能耗均较高; （2）对环境污染极为严重,现广西每生产1吨酒精需排放12～14吨左右,COD高达12万mg/L的废液,对此废液至今尚无有效可行的处理办法。存在这些技术问题最根本原因之一是缺乏高效、高产的微生物生产菌种。 本项目基于构建拥有自主知识产权的甘蔗糖蜜酒精发酵菌种的同时,广泛开展国际合作,提出了引进巴西Fermentec公司高性能甘蔗酒精发酵生产菌种的研究计划,签订了合作协议。本项目来源于广西科学研究与技术开发计划项目,项目合同编号：桂科合10100019-21,项目执行期：2010年7月至2012年12月。 本项目技术原理： （1）从巴西引进二株甘蔗酒精发酵高产菌株,借鉴所引进菌株的基因资源,选育构建拥有自主知识产权的酒精发酵野生型酵母菌株,建立菌种库,选择三株酒精发酵相关性状不同的菌株进行全基因组测序,识别出56个与酿酒酵母酒精发酵相关的调控基因。 （2）项目建立了异源基因在野生型酿酒酵母的核基因组稳定表达技术。 （3）利用表达技术和高通量筛选培养基,采用异源基因表达和同源基因置换的策略,构建了11株甘蔗糖蜜酒精发酵高产酿酒酵母生产菌株,实验证实了3个与酿酒酵母酒精发酵相关的新基因。 本项目合同约定的考核指标： 技术指标（1）构建2～3株酵母菌株,菌株利用甘蔗丙蜜发酵生产酒精的产酒率＞15%（V/V）,发酵醪液残糖含量≤1.5%（W/V）,发酵时间≤35小时;（2）申请国家技术发明专利1项;（3）发表学术论文3篇以上,其中在国内核心刊物发表2篇以上,国外SCI发表1篇。经济指标：完成10吨规模的发酵试验（中试）。 项目组完成了： （1）构建了11株甘蔗糖蜜酒精发酵高产菌株,其中5株发酵甘蔗糖蜜的成熟醪酒精浓度达到16%（V/V）以上,发酵醪液残糖含量最低可达0.3%,发酵酒精浓度为15%（V/V）的时间为32小时; （2）申请国家技术发明专利1项; （3）发表与项目相关的研究论文6篇,其中在国内核心期刊发表5篇,在国外SCI刊物发表1篇;利用所构建的酿酒酵母高产菌株研究建立了甘蔗糖蜜酒精高浓度发酵生产工艺,并将技术用于年产5万吨甘蔗糖蜜酒精规模的工业化生产。项目实施期间实现产值1.6亿元,税利1413.13万元。 本项目研究水平： 国外以糖蜜为原料发酵生产酒精的国家主要有印度、澳大利亚、欧洲（以甜菜糖蜜为原料）和巴西（甘蔗糖蜜和甘蔗汁混合发酵）等。我国的甘蔗糖蜜酒精发酵产业主要分布在广西、广东西部地区、云南等蔗糖产区。现国外糖蜜酒精发酵生产所使用的菌种主要有巴西的CAT-1和PE-2二株酿酒酵母高产菌株（现巴西60%的厂家,80%的产能使用）,以及各国自己选育的酿酒酵母生产菌株,发酵的酒精浓度一般为9-11%（V/V,糖蜜为原料）和12-13%（V/V,糖蜜与甘蔗汁混合发酵）,发酵效率一般为理论值的91%左右。巴西Fermentec公司最近二年筛选得到了发酵酒精浓度达到16%（V/V）,发酵效率达到理论值的92%以上的酿酒酵母生产菌株,正在其国内逐步推广应用。国内甘蔗糖蜜酒精产业使用的生产菌种主要是安琪活性干酵母,个别厂家使用固定化酵母或由科研机构提供的非商业化酵母菌株,发酵的酒精浓度一般为9-10%（V/V,夏天）或10-11%（V/V,冬天）。本项目构建了11株符合工业生产要求 的甘蔗糖蜜酒精高产、高效、高抗酿酒酵母生产菌株,并建立了甘蔗糖蜜酒精高浓度发酵生产技术,实现了技术的工业化应用,工业生产水平上甘蔗糖蜜酒精的发酵浓度最高达到了15.4%（V/V）,发酵效率达到了理论值的94%,各项技术指标处于国际先进水平。 本项目成果的创造性和先进性主要体现： （1）通过建立野生型酿酒酵母菌株的稳定单细胞系,建立了一套至今国内外尚未见报道的异源基因在野生型酿酒酵母菌株的核基因组稳定表达技术; （2）从同一陈年甘蔗糖蜜环境筛选到酒精发酵相关性状不同的系列野生型酿酒酵母菌株,开展了酿酒酵母比较基因组学研究,识别出56个与酿酒酵母甘蔗糖蜜酒精发酵相关的调控基因; （3）以比较基因组学研究为基础,利用所建立的异源基因表达技术,构建了11株符合工业生产要求的酿酒酵母甘蔗糖蜜酒精发酵基因工程菌,建立了甘蔗糖蜜酒精高浓度发酵技术,并实现了技术的产业化应用,在国内外首次将野生型酿酒酵母的基因工程菌于酒精发酵工业生产,各项技术指标达到了国际先进水平; （4）发现了3个与酿酒酵母酒精发酵相关的新基因,显著提高了我区酿酒酵母的研究水平。 本项目所构建的酒精发酵酿酒酵母高产基因工程菌株可显著提高甘蔗糖蜜乙醇的发酵浓度和发酵效率,减少废水排放。节能减排30%以上,具有良好的推广应用前景。