[01377016]海洋植物内生真菌新农用抗菌物质的发掘及多样性强化提取研究

1.课题来源与背景 自然界微生物生存环境恶劣,微生物对相应环境的适应诱使其产生了多样的次生物质。因此,将微生物在某种或某些易吸收营养元素匮乏或需从难吸收复杂营养源中分解获取其中蕴含的少量必需元素的条件下培养,菌株代谢机能被迫高速运转,其代谢某些拮抗物质的能力有可能被激活,从而产生新颖的活性物质。迄今为止,基于此思路采用改变培养基前后对比的方式发掘海洋微生物新天然产物的报道较少。“天然产物多样性强化提取法”,即不以纯的天然产物为先导物进行合成,而直接以混合的天然产物粗提取为原料进行化学反应,可以省去前一步高工作量的分离纯化工作,并有可能进一步增加产生新的天然产物类似物甚至新骨架化合物的概率。目前相关研究报道很少。基于以上原因在广州市科技计划基金资助下,本项目开展了海洋植物内生真菌新农用抗菌物质的发掘及多样性强化提取研究。 2. 研究目的与意义 本研究开展4株筛选出的海洋植物内生真菌在低易吸收或无易吸收氮源培养条件沉默途径被激活产生的新颖农用抗菌物质的分离、活性研究,并检测低易吸收或无易吸收氮源培养是否新化合物产生的关键原因;同时将“强化提取法”运用在2种海洋菌株产物研究上,获取新天然产物类似物;开展活性单体、提取物农用抗菌制剂配方研究,为高效发掘海洋植物内生真菌代谢产物中新杀菌农药先导化合物的应用提供理论和实践依据。 3.主要论点与论据 项目技术路线集菌株发酵培养、提取分离、结构鉴定、活性测试为一体,其科学性具体体现在： （1） 菌株发酵条件是保证菌株代谢产物对两种以上植物病原菌显示出强抗菌活性的优化条件,从而保证成功分离到具有强抗植物病原菌活性的单体。 （2） 提取方面,首先进行低温浓缩,基本不破坏代谢产物有效成分;接着采用分段萃取,将菌株代谢产物分成了不同极性部位,方便了后续分离纯化。固体培养基采用95%乙醇进行提取,毒性低。 （3） 分离纯化方面,采用的硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH-20、制备薄层层析技术等是早已被长期实践证明的科学有效的技术手段,而制备高效液相色谱技术是现代色谱分离技术,已成为不可缺少的天然产物分离纯化的高效手段。同时在分离过程中采用活性和核磁共振氢谱双重跟踪技术进行指导,具有较高的科学性和先进性。 （4） 单体结构测定方面,采用现代仪器设备包括紫外光谱仪、红外光谱仪、核磁共振仪、高分辨质谱仪、圆二色谱仪等进行单体化合物的各项波谱数据采集,并运用有机波谱学方法分析数据,解析化合物结构,从而使整个项目的研究效率得到提高。 （5） 单体活性测定与评价方面,主要采用二倍稀释-观察法和滤纸片扩散法测试体外抗菌活性,均十分灵敏,节约了样品用量,使后续盆栽和水果保鲜防病试验样品更为充足。作物盆栽和水果保鲜防病测试方面,主要依据被广泛认可的田间农药施药准则进行。 （6） 菌株代谢产物多样性强化提取方面,选用的是经系统或初步分离后的菌株重新发酵,针对性强,主要根据已分离化合物的官能团或结构特点,尝试不同合成方法进行强化提取反应预试验,用先进的HPLC-MS技术与原提取物的LC-MS进行对比分析,在判断强化提取反应有效的基础上再放大试验,确保项目成功获得了新的天然产物类似物。 4.创见与创新 （1）从苦槛蓝中分离内生真菌,并运用低易吸收或无易吸收氮源培养基进行活性菌株抗植物病原菌物质的分离等研究,研究对象属创新。（2）已分离到10多种具有抗植物病原菌活性的新化合物,其中部分新化合物活性优于某些市场销售的杀菌农药,对于我国农药由仿制到创制的战略转变具有重要意义。（3） 在国内外率先将代谢产物多样性强化提取法引入到海洋红树林微生物代谢产物研究中,已成功获得了2个新化合物,研究思路属拓展创新。 5.社会经济效益,存在的问题 项目拓展了农用杀菌物质的研究对象,为开发出新型强效农用杀菌剂提供了物质和数据基础,相关成果将推动农作物防病的高效与绿色化,促进农业可持续发展研究和红树林资源的保护利用,对于推动我国拥有自主知识产权杀菌农药的研制具有重要意义。 6.历年获奖情况 无 7.成果简介 项目在低易吸收氮源条件下从4株海洋植物内生真菌共分离鉴定了16种单体化合物,其中新化合物9种,新化合物中有7个在常规氮源培养基条件中未显示HPLC色谱峰,表明低易吸收氮源培养条件是其产生的关键原因;接着进行了拓展研究,从其他来源的2株真菌低易吸收氮源培养条件下分离到7个新化合物;通过对前期已系统研究过的2株真菌进行多样性强化提取研究,获得了3个新化合物,增加了2个结构罕见化合物的产量,并由此成功实现了通过量大已知物质到这两个化合物的半合成;从所得化合物中筛选到对至少一种植物病原菌抗菌体外活性接近或优于现有市场销售的杀菌农药的先导化合物19种,并进一步从中发掘出产量较高且具有较好温室盆栽和水果保鲜防病活性有望应用化合物的3种。