[01369339]基因工程菌高密度发酵与高目标产物表达的调控机理及策略研究

针对目前基因工程中普遍存在的菌体高密度发酵与低产物表达的矛盾，本课题组利用基因工程类人胶原蛋白（中国发明专利授权号ZL01106757.8）大肠杆菌表达系统，通过研究重组菌在高密度发酵下的代谢网络及其物质流、能量流的流通量，归纳不同发酵过程参数下能量物质与细胞生长速度和类人胶原蛋白生成量间的变化规律；通过研究重组菌在补料-分批培养条件下纯培养和诱导阶段产生目标产物时体系的热量变化，归纳能量物质代谢与发酵调控的热动力学、产物表达量与菌体生长动力学及其热动力学之间的相关性，建立了合理的重组菌代谢网络并确定主要代谢节点及其通量扩增工艺；建立了一套通过工程菌培养高效表达目标产物的热力学和动力学模型及工艺工程控制参数。　　课题组的研究从基因工程菌高密度发酵的机理出发，确定了基因工程菌高表达的工艺优化参数，并建立了体系动力学和热动力学模型，为下一步开发专家控制系统奠定了基础。此外，大肠杆菌是目前基因工程研究中最重要的蛋白表达载体，很多重组蛋白的表达都是以它作为载体，对其进行代谢网络及代谢调控的研究可解决菌体高密度发酵与低产物表达的矛盾，具有普遍指导意义，为工业化低成本生产提供理论基础。　　本研究的创新之处在于　　（1）建立了以葡萄糖作唯一碳源时该工程菌的代谢网络，并借助C13标记-NMR技术和代谢物平衡法对其代谢流通量进行了有效分析，确定了对细胞生长和目标产物的合成均产生重要影响的诱导前最适比生长速率；　　（2）利用元素衡算和代谢衡算（EMB）方法建立了该工程菌在分批-补料培养条件下的发酵动力学模型，确定了诱导期必须控制菌体生长以满足目标产物生成的策略；　　（3）根据重组工程菌的热谱曲线，建立该工程菌生长期和表达期的热动力学模型，确定了发酵期和表达期的最适培养温度。　　课题组建立的大肠杆菌类人胶原蛋白高密度表达体系的代谢调控理论应用于实践生产，该理论体系被成功地应用到西安巨子生物基因技术股份有限公司承担的国家发改委高技术产业化示范工程“基因工程技术生产类人胶原蛋白生物材料”的实施过程中，基因工程类人胶原蛋白Ⅰ已成功放大并投入生产，由于该理论体系与常规的工艺相比，其具有在相同生物量下的高目标产物收率特性，因此生物废渣少，同时处理过程与传统相比，节能、节电、节水。