[01361925]灰树花菌株发酵转化天麻提取物促进真菌多糖代谢的研究

一、成果来源与背景 本研究工作是基于微生物发酵应用于中药炮制的基础之上,其主要研究目的是运用不同相关方法、从不同角度研究天麻中的主要成分在灰树花发酵生长代谢过程中的变化,试验探明灰树花发酵转化天麻的增效机理及它们间的相互作用,为实现药用真菌发酵生产与中药生物转化的结合进行中药新药（或活性化合物）的创制提供理论基础。 任务来源于国家自然科学基金地区基金项目（31060272,灰树花GZD-032菌株发酵转化中药及其增效机理的研究）及贵州省优秀科技教育人才省长专项基金（黔省专合字[2009]106号,药用真菌灰树花转化中药天麻及其增效机理研究）。 二、技术原理及性能指标 1、技术原理 （1）研究灰树花发酵天麻培养液抗肿瘤活性增效的物质基础。对灰树花发酵天麻培养液以溶剂萃取及各种柱层析分离（硅胶柱层析、凝胶柱层析、制备HPLC等）等分离纯化方法,结合MTT法药理筛选（检测样品对S180、BEL7402肿瘤细胞株的细胞毒活性及其对小鼠淋巴细胞体外增殖的影响）对灰树花发酵天麻培养液抗肿瘤增效作用物质基础进行系统研究,找到其单体活性成分及转化所得新成分。 （2）天麻成分对灰树花多糖合成代谢的影响。灰树花的主要活性成分为灰树花多糖,根据微生物多糖合成代谢的共有途径和灰树花多糖的主要单糖组成,构建出灰树花多糖合成代谢的基本途径,然后分析多糖合成和糖酵解的各个分支途径。灰树花多糖合成的途径和糖酵解途径的关键酶分别是α-磷酸葡萄糖变位酶和磷酸萄糖异构酶。因此,通过测定α-磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶酶活的测定,完成酶活动力学曲线,然后对这些曲线进行分析比较,再结合补加天麻成分后产物多糖的组成变化进行分析,则可初步阐明补加天麻成分对灰树花多糖合成代谢的影响。 （3）天麻提取物及灰树花发酵液成分分析方法优化。在前期研究中,已经确定了几种天麻提取物中的成分,建立了可靠的HPLC分析方法,并将同样HPLC分析方法运用到灰树花发酵液中天麻成分的分析。 （4）利用建立的方法,研究天麻成分与灰树花生长代谢间相互作用过程的成分变化,同时结合液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术进一步确认增效的物质基础及对新化合物的结构鉴定。 2、性能指标 （1）从发酵动力学的角度来说明了灰树花与天麻的相互作用。通过MATLAB软件,运用非线性拟合的方法,分别得到了两组灰树花深层发酵的动力学模型。 （2）利用HPLC和LC-MS初步定性和定量分析天麻提取物中的主要成分,它们分别是天麻素、对羟基苯甲醇、单取代巴利森甙、对羟基苯甲醛、巴利森甙C和巴利森甙。 （3）在发酵代谢途径的研究中发现,两组天麻成分的添加不仅对灰树花代谢、EPS产量和菌体干重均有促进作用,而且α-葡糖磷酸变位酶（α-PGM）酶活力有明显上升,相反,葡糖磷酸异构酶（PGI）酶活力有所降低。 （4）对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛能显著促进灰树花细胞的生长和胞外多糖的合成,对羟基苯甲醛的促进作用优于对羟基苯甲醇。结果显示,对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛是天麻提取物对灰树花发酵起促进的作用的关键成分。 （5）灰树花胞外多糖的活性检测试验结果表明：实验组2（加入新鲜未经硫磺熏蒸处理的天麻醇提成分）能起到抑制A549细胞的活性作用,实验组1（加入常规药店加工生产销售的天麻醇提成分）能促进小鼠脾淋巴细胞（B细胞）增殖,其有免疫活性作用,两组灰树花胞外多糖均能促进小鼠脾淋巴细胞（T细胞）增殖,有一定的免疫活性作用,而对照组（未加天麻醇提成分）在三个试验中均无明显生物活性。 （6）本研究首次报到了灰树花菌株51616对天麻主要成分的影响：在灰树花深层发酵过程中,灰树花具有利用自身的细胞或酶系合成天麻素的功能,而且天麻的主要成分-天麻素可以重新再合成巴利森苷。同时又分析了巴利森甙裂解产生的天麻素残基在灰树花发酵过程中的变化情况,并提出了灰树花同时具有转化天麻素和合成天麻素的双重作用的假设。 （7）添加天麻提取物后灰树花发酵液提取物清除DPPH能力提升,且灰树花发酵液提取物还原铁离子能力增强,同时其螯合亚铁离子的作用也明显增强。 四、技术创造性及先进性 1、研究发现,天麻提取物中除天麻素外,含有对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇和巴利森甙等物质; 2、建立了天麻提取物和灰树花菌株发酵液成分的HPLC、LC-MS等分析方法; 3、天麻提取物能明显促进灰树花菌株深层发酵合成胞外多糖,其机制主要与对羟基苯甲醛和对羟基苯甲醇促进细胞和α-葡糖磷酸变位酶（α-PGM）活力、抑制葡糖磷酸异构酶（PGI）活性有关,其中对羟基苯甲醛的作用优于对羟基苯甲醇; 4、分析测定表明,灰树花菌株发酵体系具有利用对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇和巴利森甙等物质形成天麻素的机制; 5、发酵合成的多糖具有促进淋巴细胞增殖、抗肿瘤细胞、抗氧化的活性。 五、项目取得成果 获得国家发明专利授权1件;发表研究论文14篇,其中SCI论文2篇、国际学术期刊2篇、中文核心期刊论文10篇。