[01349582]检测H1和H3亚型猪流感病毒RT-PCR方法的建立及其应用

本课题属于畜牧兽医学科兽医学领域的研究内容。 立项依据 猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）不仅引起病猪呼吸困难及其它病毒和细菌继发感染,给养猪业造成重大经济损失,而且严重威胁人类健康。2009年H1N1 猪流感病毒引发的流感疫情再次警示人们控制猪群中的流感病毒,即是从源头上控制人类流感病毒。虽然猪群中的流感病毒亚型众多,但H1和H3亚型SIV最为常见。因此,建立一种快速检测H1和H3亚型流感病毒的方法,对猪群中流行的H1和H3亚型流感病毒进行监测,不仅具有重要的经济意义,而且具有重要的公共卫生意义。 PCR是检测临床样品中病原体的快速、敏感和特异的分子生物学方法,特别是多重PCR可同时检测样品中的多个病原体,在检测猪群中常见的H1和H3亚型猪流感病毒时优势更加明显,因此 本研究旨在建立检测H1和H3亚型猪流感病毒的多重RT-PCR,快速检测猪群中常见的H1和H3亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的监测、预防和治疗奠定基础,进而从源头上预防人类流感的大流行。 研究内容 1根据GenBank已发表猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）H1和H3亚型血凝素（hemagglutinin,HA）基因核酸序列,应用DNAStar进行同源性分析,分别获得各病毒高度保守区域,利用软件Oligo 6.0设计2对特异性引物,利用RT-PCR,分别扩增出了大小为537bp和793bp的片段,与预期片段大小一致,并对所扩增产物进行了序列测定,测序结果表明所扩增序列分别与H1和H3亚型SIV参照序列一致。随后进行了特异性和敏感性及临床样品的检测,结果表明,所建立的检测H1和H3 亚型SIV的单项RT-PCR方法具有较好的特异性和较高的敏感性,并能用于临床样品的检测。 2 多重PCR反应参数优化：对多重PCR反应参数进行优化,包括退火温度、延伸时间、引物浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度及Mg离子浓度进行优化,确定了25μL体系的最佳反应参数,退火温度是58℃,72℃延伸50s,H1上、下游引物各0.2μL（10 μM）,H3上、下游引物各0.3μL（10 μM）,dNTP（各 2.5 mM）2 μL,Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL,Mg离子（25mM）2.0 μL, 10×buffer（500 mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3）2.5 μL。随后,在最佳反应参数下,进行了多重PCR特异性和敏感性实验,结果表明,该多重RT-PCR能同时特异性扩增H1和H3亚型SIV,而对猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）和伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）扩增结果为阴性,其检测敏感性如下,H1亚型SIV最低检出量为1.0×102 EID50/250μL,H3亚型SIV最低检出量为3.0×102 EID50/250μL,并可用于临床样品的检测,为猪群中H1和H3亚型型流感病毒的临床诊断和流行病学调查奠定了基础。 3 从安阳、济源、鹤壁、濮阳、新乡、焦作、平顶山和南阳等地猪群中,采集眼观健康猪鼻棉拭子816份、有呼吸道症状猪鼻棉拭子1200份和有呼吸道症状病死猪肺115份,利用H1和H3亚型SIV 多重RT-PCR检测,结果表明816份眼观健康猪棉拭子中,H1亚型SIV阳性率2.1%（17/816）,H3亚型SIV阳性率2.9%（24/816）;1200份有呼吸道症状猪棉拭子中,H1亚型SIV阳性率为16.3%（195/1200）,H3亚型SIV阳性率为23.2%（278/1200）,其中H1和H3亚型SIV阳性率为6.2%（74/1200）;115份有呼吸道症状病猪肺中,H1亚型SIV阳性率为20.9%（24/115）,H3亚型SIV阳性率为30.4%（35/115）,其中H1和H3亚型SIV阳性率为11.3%（13/115）。 本研究的创新点 1 分别建立H1和H3亚型SIV特异的RT-PCR,产物大小分别为537bp和793bp,研究结果表明,所建立的检测H1和H3 亚型SIV的单项RT-PCR方法具有较好的特异性和较高的敏感性,并能用于临床样品的检测。 2 本研究建立了一次可同时检测H1和H3亚型SIV的多重RT-PCR方法,特异,敏感,H1亚型SIV最低检出量为1.0×102 EID50/250μL,H3亚型SIV最低检出量为3.0×102 EID50/250μL,并可用于临床样品的检测,为猪群中H1和H3亚型型流感病毒的临床诊断和流行病学调查奠定了基础。 3 本研究利用所建立H1和H3亚型SIV特异性多重RT-PCR方法,对采自河南猪群的样品进行检测,结果表明816份眼观健康猪棉拭子中,H1亚型SIV阳性率2.1%（17/816）,H3亚型SIV阳性率2.9%（24/816）;1200份有呼吸道症状猪棉拭子中,H1亚型SIV阳性率为16.3%（195/1200）,H3亚型SIV阳性率为23.2%（278/1200）,其中H1和H3亚型SIV阳性率为6.2%（74/1200）;115份有呼吸道症状病猪肺中,H1亚型SIV阳性率为20.9%（24/115）,H3亚型SIV阳性率为30.4%（35/115）,其中H1和H3亚型SIV阳性率为11.3%（13/115）。这些数据不仅为河南猪群中H1和H3亚型型猪流感病毒的流行提供了理论依据,而且准确的诊断,为病猪及时预防和治疗提供了保障,有效降低了经济损失。