[01348150]哈蟆油原动物及其混伪品的COI序列分子鉴定

①项目来源与背景： “哈蟆油原动物及其混伪品的COI序列分子鉴定”为2012年吉林省中医药管理局重点研究室课题, 课题批准编号：YJS-0228。 ②技术原理及性能指标： 本项目通过对哈蟆油及其伪混品物种采集区域的筛选,确定采集地为吉林、黑龙江、辽宁、河北、内蒙古、广东、广西、陕西、山东、四川10个省份。并在以上省份中采集到了中国林蛙、黑龙江林蛙、中华大蟾蜍、花背蟾蜍、黑斑侧褶蛙、黑眶蟾蜍、东北雨蛙等7个物种。同时在GenBanK数据库下载同种的COI序列。哈蟆油实验用正品来源及其混伪品共4个属,7个种21条序列。使用动物DNA提取试剂盒提取哈蟆油原动物及其混伪品样品总DNA;利用COI序列通用引物对已提取的总DNA进行PCR扩增;使用ABI 3730XL 测序仪对PCR扩增产物进行双向测序;测序后所得序列利用CodonCode Aligner V2.06软件进行校对拼接比对;MEGA4.0 软件比对并进行遗传距离分析,用NJ（邻接）法对比对的序列构建系统聚类树;利用bootstrap （1000次重复）检验各分支的支持率。通过以上实验分析获得哈蟆油及其混伪品原动物的种内变异情况。研究所用21个样品的COI序列,比对后长度均为663bp。GC含量范围为43.6％～49.9％,平均GC含量为47.6％。种间平均K-2P距离为0.243,最小K-2P距离为0.105,种间COI序列变异较大,哈蟆油正品与其主要混伪品的COI序列间存在较多的变异位点,经MEGA软件比对,共有252个变异位点,以此分析出其种间变异情况。 对PCR产物经测序后得到正反两向峰图,采用CodonCode Aligner V2.06（CodonCode Co., USA）校对拼接获得长度为658bp的样品序列,原始图谱为清晰的单锋图谱,干扰信息低于正常信号的10%,由此可以完成物种鉴定。 采用哈蟆油的正品来源中国林蛙、习用品黑龙江林蛙以及中华大蟾蜍,明太鱼等混伪品原动物的样品序列和GenbanK同种序列构建邻接（NJ）树。NJ树可以看出,哈蟆油的正品来源能聚在一起,支持率较高,与其它同属混伪品能够很明显区分开,说明COI序列能够准确有效地鉴定哈蟆油及其混伪品。本实验运用COI条形码序列能准确鉴定哈蟆油的正品来源及其混伪品。基于COI序列的DNA条形码技术可以很好的鉴定哈蟆油的正品来源及其混伪品,为该药材的准确鉴定找到了可靠、有效的分子遗传标记方法。 ③技术的创造性与先进性： 本实验证实,只要获得待测样品的COI序列,与GenbanK数据库中的正品来源及其混伪品序列构建NJ树,就能一目了然地看出聚类情况,鉴定其真伪。此研究不仅为哈蟆油的鉴别提供了新的可行性方法,在其他动物药品种鉴定中也具有较大的应用价值。 同时,扩充了条形码数据库中药用动物序列,并建立了COI条形码鉴定动物药品种的具体技术流程。 ④技术的成熟程度、使用范围和安全性： 本项目利用COI序列对哈蟆油及其常见混伪品进行DNA条形码鉴别,为哈蟆油的鉴别提供了新的可行性方法,在其他动物药品种鉴定中也具有较大的应用价值。由此可以纠正中药市场”以次充好“”以假乱真“的乱象,促进市场规范化的同时大大提高中药使用的安全性,对医疗健康产业做出巨大贡献。 ⑤应用情况及存在的问题： 因资金来源不足,本成果尚未大范围应用。 ⑥历年获奖情况。 2009 年12月,“长白山道地药材化学成分分离鉴定”获吉林省科技进步二等奖;2008 年11月,“我国名贵珍稀动物药的基础研究”获吉林省科技进步二等奖