[01293477]新癌基因PPO的克隆及在癌症诊断和治疗的应用

《新癌基因PPO的克隆及在癌症诊断和治疗的应用》是2005年国家自然基金科学部主任基金资助项目，项目编号：30440086。河北省科技攻关指导项目，项目批号：052761201。该项目自2005年1月开始截止到2005年12月结束。现对研究工作进行总结。　　1.许多细胞遗传学异常现象显示，1号染色体和1号染色体末端1p36区存在杂合性缺失和染色体获得。这些报道提供的细胞异常现象与多种癌症有关，而且提示在此区可能存在重要的抑癌基因或癌基因。因此，我们完成了1p35-1p36的基因图谱的制作，这是人类基因组工作的一部分。　　2.利用众多的基因图谱标志EST克隆目的基因是一种高风险的工作，失败的机率常在95%以上。其它克隆目的基因的方法也非常复杂，现在已经进入后基因组时代，人类3万个基因的功能亟待人们去解析。我们经过反复筛选，在1p36.13区发现并克隆出了PPO(Proliferation and Phosphorylation Oncogene 120 kD)基因。定量PCR结果显示，该基因在多种癌组织和肿瘤细胞株中有过表达，可能是一个新的癌基因。　　3.同源基因类比比较研究是基因研究的最基本工作，利用PPO基因的蛋白质序列，我们首次发现了小鼠、果蝇、蚊子、线虫、酵母的和PPO的同源基因，将为人类基因的研究提供帮助。　　4.基因重组是研究基因的基本方法，我们将PPO基因装入pcDNA3.1/V5His载体，验证并证实基因重组成功，细胞免疫染色显示PPO蛋白质存在细胞于细胞质中。　　5.PPO基因与细胞增殖有关。①定量PCR显示该基因在卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、脑胶质细胞瘤等多种癌组织和细胞株中都有过表达，推测该基因与多种癌症的形成有密切关系。进一步研究表明PPO基因导入的NIH/3T3细胞：①细胞核增殖标记抗原PCNA(proliferating cell nuclear antigen)表达明显增多；②能够形成细胞叠加现象；③在软琼脂上培养时，细胞集落形成能力增加；④活体实验能够明显刺激细胞生长，并具致瘤性。这些结果从细胞水平到活体水平证实该基因与细胞增殖关系密切。　　6.PPO基因与磷酸化有关。PPO基因能够使MAPK通路中的MEK1/2和ERK2磷酸化，推测PPO和磷酸化通路MAPK有一定关系。MAPK通路是癌症发生的重要通路，许多癌基因与此通路有关，具体PPO如何在MAPK通路中发生作用以及和其它基因的关系，有待进一步研究。　　7.利用RNA干扰的方法，从反面证实该基因的功能。PPO基因的RNA干扰试剂能使PCNA及p-MEK表达量明显减少。细胞增殖和磷酸化减少，从反面证实了PPO的功能。利用RNA干扰卵巢癌细胞株OVK18，OVCAR-3、PCNA及p-MEK表达量明显减少。从细胞水平证实能够抑制癌细胞生长。利用RNA干扰卵巢癌细胞株OVCAR-3的活体实验，两次试验的结果，显示能够抑制卵巢癌细胞在活体上的生长，使瘤体缩小。因此，通过RNA干扰，特异性的抑制癌基因的过表达，用来治疗癌症，是分子靶向治疗的一种新方法，将为癌症治疗开辟一个新的天地。　　8.为进一步研究PPO基因的功能，我们制备了高特异性的抗PPO的单克隆抗体。该抗体的制备将为下一步研究PPO基因与其它类型癌症的关系提供重要帮助。　　9.利用我们制备的抗PPO的单克隆抗体，采用蛋白免疫印迹及免疫组化的方法对PPO基因在恶性黑色素瘤中的表达及其相关问题进行了研究。结果证实在88%(15/17)的临床病理证实为恶性黑色素瘤的组织中PPO高表达，而在100%(15/15)的良性肿瘤黑色素细胞中均未见表达。提示：新癌基因PPO对恶性黑色素瘤的临床诊断甚至治疗可能有重要参考价值，如当黑痣有明显的PPO表达时应考虑恶变。　　这些研究结果只是揭开了冰山的一角，新癌基因的发现是对遗传学和肿瘤学的巨大贡献。关于PPO的功能解析，我们仍有很多工作要做。