[01283857]假型H5N1型禽流感病毒细胞侵染模型的研究

该项目为河南省高校杰出科研人才创新工程项目。项目编号为2006KYCX020,应用领域为畜牧兽医领域或生物技术领域。 本项目主要技术指标及性能如下： 1.根据 GenBank 中公布的 AIV H5N1亚型的基因序列,分别设计P1/P2、P3/P4 2 对引物,其中 P1/P2 用于AIV H5 基因的扩增,P3/P4 用于AIV N1基因的扩增。以 pMD-19T-H5 和 pMD-19T-N1为模板,建立 PCR 反应体系。用 P1/P2 引物扩增出 AIV HA 基因全长序列（1707 bp）,用 P3/P4 引物扩增出了 AIV NA 基因全长序列（1350 bp）。 2.取上述 PCR 产物于 10 g/ L 琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定,并纯化回收。将回收后的 H5 和 N1基因序列,分别进行 EcoR V,XhoⅠ双酶切后纯化回收。用 T4 连接酶将回收的目的片段分别与经同样双酶切处理的 pcDNA4.0 载体连接,转化感受态细胞大肠杆菌 DH5α。产物经 Amp+抗性和 PCR 鉴定筛选后提取质粒,分别进行 EcoR V,XhoⅠ双酶切鉴定及 PCR 鉴定,分别得到了1704bp 和1350bp 的目的条带,并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序结果显示,目的序列与标准序列一致,表明载体构建成功。鉴定为阳性的质粒分别命名为 pcDNA-HA 和 pcDNA-NA。 3.采用磷酸钙转染的方法获得模型病毒。培养 293T 细胞,转染前一天将 293T 细胞传代至 10 cm 培养皿,使细胞密度为 2×106个/皿,pNL4-3.luc.R-E-10?g 和 pcDNA-HA、pcDNA-NA 的表达质粒各 10?g 共转染293T 细胞,16 h 时换液,继续培养 24 h后,收取细胞培养上清,1000 r/min 离心 5min 去除细胞碎片,0.45μm 滤膜过滤,保存于 -80 ℃,命名为HIV/HA-NA。阴性对照使用不含外源片段的 pcDNA4.0,命名为 HIV/PC。 取上述处理过的模型病毒上清,20 ﹪ 蔗糖垫底40 000 r/min 超速离心2 h,PBS 悬浮病毒沉淀。取适量病毒沉淀加入等量的2×裂解缓冲液煮沸裂解5 min,用禽流感病毒H5N1亚型阳性血清和兔抗鸡酶标二抗进行Western blot检测,显示出 4条特异性目的条带,其中包括 HA 蛋白未经切割的前体蛋白 HA0 （分子质量约 76 ku）以及切割后形成的亚单位 HA1（分子质量约 47 ku）和 HA2（分子质量约29 ku）,NA蛋白（分子质量约52 ku）4条目的条带。结果表明HA、NA在模型病毒颗粒表面得到了成功表达。 4.传293 T、BHK、VERO、IBRS22 和 MDCK 共 5 种细胞株于 24 孔板中（2×104～8×104 /孔）,24 h 后用于模型病毒的侵染。结果表明,该病毒模型对 293 T、MDCK 细胞的感染性高,对 BHK 和 VERO 细胞的感染性居中,而对 IBRS22 不感染,这与 H5N1型禽流感病毒对这些细胞的感染情况一致。 5.选取 H5N1型病毒敏感细胞 293 T 接种于 24 孔板（2×104～8×104 / 孔）,24 h 后用于模型病毒的抗体阻断试验。结果显示,当阳性血清浓度小于1：1000 稀释时,Luciferase 活性阴性对照（HIV/PC）和试验组（HIV/HA-NA）差异不显著;当阳性血清稀释大于 1：10 000时,Luciferase 活性检测表明阴性对照和阳性对照差异极其显著。由此表明,低浓度阳性血清无法阻断模型病毒侵染,较高浓度的阳性血清可以阻断模型病毒侵染。 本项目构建了包含AIV HA 和 NA 两个基因的HIV 病毒模型,以期能够很好的模拟 AIV 病毒,获得更接近真实状态的病毒模型。特异性侵染研究表明,该模型病毒具有和AIV 病毒相同的细胞嗜性,能够真实地模拟对宿主细胞的入侵。抗体阻断试验证明其可以被 H5N1型 AIV 阳性血清所中和。HIV/HA-NA 侵染模型病毒将成为 AIV 研究过程中极为有价值的工具。