[01279349]鱼类嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联疫苗的研制与应用

该项目为2013年河南省科技厅科技攻关项目，编号为：132102310165。

近年来，随着我省水产养殖业迅猛发展，由致病性嗜水气和维氏气单胞菌引起的暴发性出血病危害日益严重。

由于各地区嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌毒株变异很大，血清型众多，单个毒株的疫苗很难被用于多个菌株的控制，同时不同血清型和毒力基因型疫苗菌株的选择，在不同地区的免疫效果会有较大的差异。

因此针对豫北地区嗜水气和维氏气单胞菌流行菌株类型，进行疫苗菌株的筛选，研制疫苗，助于减轻嗜水气和维氏气单胞菌不同血清型引起的各种问题，提高免疫效果，对豫北地区的水产从我省豫北地区筛选的菌株中，选择4种毒力因子相对表达量均高的毒性强的菌株活化，作为疫苗制备备用菌株：嗜水气单胞菌XDMG（1），其LD50为1.5×105cfu/mL。维氏气单胞菌XDLG（1），其LD50为4.5×105cfu/mL。

以上菌株均于2013年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏号分别为CCTCC NO: M 2013566和CCTCC NO: M 2013565。

养殖有着很重要的实际应用价值。

全菌灭活疫苗的制备及免疫效果研究：采用甲醛灭活制备疫苗，对银鲫（30-35g）进行腹腔注射，进行血清抗体效价检测，病理切片分析和攻毒保护试验结果表明，银鲫在经注射免疫后，第3周即检测到凝集抗体，于第6周凝集效价达到高峰，而对照组在整个实验过程均没有检测到抗体。

病理切片也表明，该疫苗能够对银鲫靶器官产生很好的保护作用。

实验室攻毒保护试验中，免疫组的免疫保护率达100%，且免疫保护期长达6个月以上。

口服疫苗的制备及免疫效果研究：

在均质匀浆机的搅动下，将海藻酸钠和上述灭活菌液以体积比1：1的比例配成海藻酸钠一抗原乳浊液，其中海藻酸钠浓度为2.0%W/V，搅拌温度为45 ℃，菌胶比为1：6，搅拌速度为6 0 0r/m/min，乳化时间为l 5min;

该乳浊液经喷雾干燥机雾化后直接喷入经磁力搅拌机搅动的含有2%CaCl2的pH=3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，形成海藻酸钙微囊，经离心，收集海藻酸钙微囊;

再将收集的微囊冷冻干燥后，封盖包装;

其中所述的海藻酸钙控释微囊包裹灭活嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的包封率为（96.31士0.20）%，载菌量（2.37士0.36）×108cfu/mg，平均粒径较小 （10.35μm士 0.163μm），粒径分布较均匀。

以海藻酸钠为壁材，嗜水气和维氏气单胞菌灭活全菌为芯材，利用乳化喷雾法制备嗜水气和维氏气单胞菌－海藻酸钙微囊口服疫苗，免疫银鲫后第3周即检测到凝集抗体，于第6周凝集效价达到高峰，而对照组在整个实验过程均没有检测到抗体。

病理切片也表明，该疫苗能够对鲫鱼靶器官产生很好的保护作用;实验室攻毒保护试验中，免疫组的免疫保护率达46.7%，且免疫保护期长达6个月以上同时免疫银鲫后，能够显著提高其血清酶和白细胞吞噬活性，微囊在模拟胃肠条件下稳定，表现出较好的突释性与缓释性;微囊中细菌抗原性保持良好，疫苗安全性与储存稳定性较好。

嗜水气和维氏气单胞菌二联口服疫苗对水产动物有显著的免疫保护效应，可作为豫北地区预防细菌性败血症感染的疫苗。

嗜水气及维氏气单胞菌二联注射及口服疫苗在水产养殖中的应用，减少了传统抗生素和化学药物防治的使用及水环境污染，提高了水产品质量，同时降低了鱼病防治成本。

本成果在合作单位示范点推广，累积示范面积88亩，养殖水产动物死亡率降低20%以上，减少经济损失约5万元，与对照池塘比直接经济利润达8万元。

公开发表了3篇学术论文;申请专利公开3项（见附件）。

因嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌血清型众多，不同地区分离的菌株差异明显，本项目首次研究出适合本地区的疫苗，有助于提高动物对相关疾病的免疫力，具有显著的经济、社会和生态效益。