[01272009]高产金属硫蛋白菌株的选育及其高效纯化技术研究

一、课题简介

1、课题来源“高产金属硫蛋白菌株的选育及其高效纯化技术研究”是2014年经黑龙江省农星总局批准的科技攻关类项目。项日编号为HNK1258-13-05。起止年限为2014年9月至2016年9月。

2、项目创新点首次采用三重复合诱变方法篇选高产MT的酵母菌标;采用响应面分析法，确定酵母源MT生产的最优工艺参数;利用双水相草取系统对酵母源叮进行提取和纯化，优化MT的最优纯化工艺。

二、项目研究成果

1、项目以酿酒酵母31206作为出发菌株，采用三重复合处理对金属硫蛋白产生菌的诱变效果进行了研究，结果表明三种处理方法都有很好的诱变效果，但NTG诱变的效果最好。获得的一株酵母突变株的巯基活性达到0.146umol，金属硫蛋白产量达到163.4ng/Ll，比原出发菌株高5倍的高产突变株N-8，经四次传代培养，其遗传稳定性较好。通过诱变方法选育优质、高产的金属硫蛋白菌株，为日后工业化生产金属硫蛋白奠定了基础。

2、通过对醒酒酵母突变菌株N-8生产类MT的摇瓶发酵培养过程的研究，考察了诱导培养时间、诱导培养温度、诱导剂浓度等培养条件对MT产量的影响。

试验数据进行分析，求得最佳提取方案为：诱导剂浓度为0.7mol/L，诱导培养时间为62h，诱导培养pH6.4，诱导培养温度为30℃。按照以上培养条件安排实验，测得类金属硫蛋白产量为170.91ng/L。

利用双水相萃取酵母源MT，在单因素的基础上采用Box-Behnken中心组合设计试验以及响应面分析，确定双水相萃取Cu-MT的最佳工艺条件。充分说明可以采用双水相系统萃取MT，优化后的工艺条件是可行的。本实验尝试了一种步骤简单、快速、适宜工业化生产的提取纯化MT的方法，对相关研究具有一定的考价值。

项目推广应用前景

金属硫蛋白（Metallothionein，简称MT），是一类存于细胞内的富含半胱氨酸残基，可被全属高度诱导表达的低分子量金属结合蛋白。研究发现MT主要具有调节生物体内微量元素浓度、对重全属解毒、清除体内自由基和防止机体衰老，以及增强机体对各种不良状态的适应能力和调控机体生长发育与细胞代谢等重要的生理功能。基于MT对生物机体的重要生理功能，目前受到人们越来越多的关注。自然界中人体、动物、植物、微生物体内均含有一定量的MT。

从动物体内提取MT，对实验设备和条件要求较高，在常规实验室难以开展此项研究，且资源消耗巨大，周期长等缺点;使MT的推广及应用受到了局限。

MT当前国内仅有几家生产MT的厂家，主要从兔肝中提取，由于MT原料需求特别，而且生产工艺复杂，目前MT产量不大，需求量增长缓慢，其主要原因是MT价格昂贵，一些MT保健品出口国外，在国际市场上，MT每毫克售价高达66美元，在国内，初级产品一般要卖到5-6元/mg，精品售价10-15元/mg，具有极为广阔的市场空间与利润空间。

本项目首次以产蛋白质酵母菌作为金属硫蛋白的安全来源，利用酵母菌生产成本低，生产环境易于控制，相对安全可靠的特性，通过三重复合诱变技术筛选高产MT的酵母菌菌株:并探索利用该突变菌株产MT的生物合成途径和MT最佳提取条件;利用双水相萃取酵母源MT，以期为MT在食品和保健品领域的开发提供技术支持。

本课题组还将进一步从代谢工程角度对发酵条件等方面进一步优化，提高MT的产量，降低生产成本，并进一步在MT的分离纯化上作深入的研究。

随着科技的发展和应用研究的深入，MT的应用领域不断扩大，质量也会越来越高。