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一、课题来源
此课题为吉林省科技发展计划应用基础引导项目,由吉林省科学技术厅资助,项目编号为20070569。
二、技术原理和性能指标
1、技术原理
牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的以牛为主的多种动物共患的人兽共患传染病。牛感染牛分枝杆菌后,机体会产生细胞免疫和体液免疫,而且二者呈分离现象,即细胞免疫随病情好转而增强,体液免疫随病情的恶化而增强。细胞免疫采用PPD皮内变态反应进行检测,体液免疫则采用PPD-ELISA进行检测。变态反应已被国际动物卫生组织(OIE)指定为牛结核病的检疫方法,一些发达的国家采用该方法消灭了牛结核病。但是,因PPD存在着极其严重的非特异性反应,致使许多非结核病牛误判为结核病牛,从而造成不必要的经济损失。本研究从牛分枝杆菌保护性抗原基因入手,构建多个保护性抗原基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得了目的蛋白MPB64、ESAT-6、MPB51-63、MPB63-64、MPB83-Ag85B、MPB51-63-63-64、MPB51-63-83-Ag85B,这些重组蛋白作为ELISA诊断抗原提高了牛结核病检测的特异性。
2、性能指标
(1)通过SOE PCR将牛分枝杆菌保护性抗原基因mpb51, mpb63, mpb64, mpb83和ag85b融合,获得了mpb51-63, mpb63-64, mpb83-ag85b, mpb51-63-63-64和mpb51-63-83-a85b 5个融合基因,构建了融合基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得了表达。
(2)表达产物经凝胶过滤和离子交换层析技术得以纯化,获得了MPB64、MPB51-63、MPB63-64、MPB83-Ag85B、MPB51-63-63-64、MPB51-63-83-Ag85B蛋白。
(3)与PPD比较,重组蛋白MPB51-63、ESAT-6、MPB63-64、MPB83-Ag85B、MPB51-63-63-64、MPB51-63-83-Ag85B均具有较好敏感性和高度的特异性,可用于牛结核病ELISA诊断。
三、技术的创造性与先进性。首次建立了以牛分枝杆菌重组蛋白MPB64、MPB51-63、MPB63-64、MPB83-Ag85B、MPB51-63-63-64、MPB51-63-83-Ag85B作为诊断抗原的间接ELISA检测牛结核病,并与草分枝杆菌抗原吸收的PPD-ELISA比较,提高了检测的特异性,从而可以避免不应有的经济损失,也为我国控制和消灭牛结核病提供了技术保障。通过文献调研,国内外尚未见到此研究成果相关的研究报道。
四、技术的成熟程度、适用范围和安全性。ELISA作为疾病诊断或检测技术已相当成熟,且应用范围广泛。此成果主要用于牛结核病检疫,尤其是奶牛和黄牛。此外,也可用于鹿、羊等其它动物结核病的检疫。
五、应用情况及存在的问题。此成果已在吉林省部分地区初步应用,尚需进一步推广。另外,尽管间接ELISA操作简便,便于推广,倘若能组装成结核病诊断试剂盒,将会更适于基层推广应用。
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