[01249254]高产α-葡萄糖转苷酶黑曲霉工程构建及发酵优化

本项目取得的主要成果包括创新点如下。

1. 从黑曲霉TCCC41056中克隆出具有生物学活性的TG基因。该基因全长2883bp，编码960个氨基酸。

2. 通过构建无选择标记的表达载体和建立农杆菌介导的黑曲霉的转化方法，构建了一种无选择标记的适用于黑曲霉基因重组的表达体系。确立了根癌农杆菌介导黑曲霉转化的最优条件和诱导筛选标记基因删除的雌二醇的最佳浓度及方法。

3. 构建了一株不合成糖化酶、无选择标记、能高效分泌表达TG的黑曲霉工程菌株A-8，工程菌摇瓶发酵液酶活力达4769 U/mL，是出发菌株酶活力的4.15倍。

4. 建立了工程菌的摇瓶发酵工艺，将该发酵工艺扩大到5L发酵罐，工程菌发酵72h发酵液中TG酶活力达到8016 U/mL。

5. 建立了重组TG的纯化的纯化方法。发酵液经过过滤、超滤、疏水色谱和阴离子交换色谱分离后，重组TG纯度提高了约69倍，总回收效率约72.8%。

6. 测定了重组TG的酶学性质。分子量约约109.8 kD，比理论分子量106.2 kD略大;最适pH值为5.5，pH稳定性范围在pH4pH8;最适温度为50℃，在60℃以下比较稳定。

7. 建立了一种发酵生产高纯度、能用于生产IMO的重组TG的制备方法。

重组TG在温度50-55℃，pH5.0-5.5条件下，催化麦芽糖含量大于或等于70%的糖浆制备IMO时，IMO含量约66%-71%，重组TG催化底物的转化率超过66%，最高达到71%在获得的IMO中，潘糖含量约37-40%、异麦芽糖约为21-26?%。

8. 申请专利1项;发表论文4篇，其中SCI1篇，EI1篇，核心期刊1篇。培养博士生1名，硕士研究生4名。

9. TG是生产IMO的关键酶。由于生产TG菌种的表达量低，不能满足工业化生产要求，同时纯化时糖化酶不容易除去，生产成本高，TG生产一直没能国产化。

10.本项目开发出不表达糖化酶、高产TG的、高产TG的工程菌，为TG的大规模生产及应用奠定基础。