[01221791]重组IL-12转导DC细胞特异性抗肿瘤疫苗的研究

一、课题来源与背景 “重组IL-12转导DC细胞特异性抗肿瘤疫苗的研究”项目,2002年列入吉林省卫生厅医学科研基金计划（20020321）;2003年又争取了吉林省发改委科技计划后续资金支持,任务书编号：[2003]1268号。 二、研究目的与意义 本项目在国内外相关领域研究进展的基础上,将人IL-12融合基因克隆入慢病毒载体（pWPXLd）,将负载人IL-12基因的慢病毒载体高效转染DCs,提高DCs抗肿瘤免疫的应答能力。用化疗药物处理的肺癌细胞A549冲击DCs,使其进一步负载肺癌细胞的全抗原信息,增强DCs抗肿瘤作用的敏感性与特异性。该实验设计针对目前DCs疫苗抗肿瘤作用研究的瓶颈问题,从高效治疗基因的选择、高效优化的慢病毒载体介导的基因转染及负载肿瘤细胞的全抗原入手,探讨提高DCs肿瘤免疫治疗效果的新途径。 同时本项目用电穿孔方法转染癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）mRNA和结肠癌细胞株SW480总RNA至成熟树突状细胞（mature dendritic cell,mDC）内制备RNA-DC疫苗,观察体外诱导的特异性抗肿瘤效应。为RNA-DC疫苗进一步应用于临床治疗奠定基础。 三、主要论点与依据 1.成功克隆了人IL-12基因全长与IL-12基因两个亚单位的拼接; 2.成功构建了IL-12慢病毒载体与病毒载体的包装 3.包装的IL-12慢病毒载体有效地促进化疗药物作用A549细胞负载DCs 杀伤肺癌细胞的活性 4.电穿孔法能将体外转录的CEAmRNA和SW480总RNA转染入PBMC诱导的mDC中,光学显微镜观察DC形态和流式细胞术检测DC表面分子标志,表明电穿孔法未改变DC的基本特征。免疫细胞化学染色法和流式细胞术分析,转染后12hCEA蛋白能在DC内表达。 5.负载CEAmRNA的DC能显著刺激T细胞增殖。特异性细胞毒实验结果表明负载CEAmRNA的mDC能诱导出CEA特异性的CTL,且诱导的CTL上清中IFN-γ分泌量显著增高。 6.特异性细胞毒实验结果表明转染SW480总RNA的DC能够产生CEA特异性和肿瘤特异性的CTL反应,且与转染CEAmRNA的DC相比,其能诱导出针对更多未知肿瘤抗原的抗肿瘤效应。 7.成功实现IL-12基因在肝癌细胞HepG-2的稳定表达,表达的IL-12能够有效地刺激外周血淋巴细胞的增殖,并诱导出抗肝癌的免疫反应。 四、创见与创新 树突状细胞（DCs）是抗肿瘤的重要免疫细胞,人IL-12是重要的抗肿瘤免疫因子,利用该基因修饰的DCs将会促进DCs本身的成熟以及增强DCs诱导的细胞毒性T细胞的抗肿瘤活性。本项目以肺癌细胞为DCs疫苗治疗的靶细胞,利用慢病毒载体介导人IL-12基因修饰的DCs,利用化疗药物作用的肺癌细胞A549冲击基因修饰的DCs。通过观察慢病毒载体介导人IL-12基因的DCs转移效率、IL-12基因在DCs内表达,以及DCs成熟与诱发的针对肺癌细胞A549的细胞毒作用等几个方面来对慢病毒载体介导的人IL-12基因修饰的DCs疫苗体外抗肺癌的效果进行评价。经优化设计后的重组IL-12基因DC疫苗,克服了以往肿瘤疫苗研制过程中的不足,最大程度采取了充分发挥抗肿瘤免疫应答多种效应途径重组基因工程策略,在一定程度上,填补肿瘤免疫生物治疗领域的空白,开辟肿瘤生物治疗新途径。 本研究的另一创新点即采用mDC作为载体,将编码癌胚抗原180Kda的的mRNA和CEA表达阳性的结肠癌细胞株SW480总RNA用电穿孔法分别转染入mDC,并观察负载不同RNA的mDC体外诱导的特异性抗肿瘤效应。研究结果证明了电穿孔不会变mDC的形态、分子表型及功能;电孔法将RNA有效的负载于mDC,并使之表达;转染CEAmRNA和转染SW480细胞总RNA的mDC在体外诱导了抗原特异性及肿瘤特异性的抗肿瘤作用;转染SW480总RNA的mDC能否诱导出比转染CEAmRNA的DC更有效的抗肿瘤作用,从而为RNA-DC疫苗进一步应用于临床治疗奠定基础。 五 社会经济效益,存在问题 该项目的优势与特色,充分吸取各种肿瘤疫苗疗法研究中杀伤肿瘤细胞作用明显,特异性强及持续时间长的特点,进行优势互补的重组基因DC疫苗的设计策略。最大程度克服目前肿瘤疫苗研究中的不足,对肿瘤防治产生深远的影响。本项目独特设计策略,将获得重组负载肿瘤抗原DC疫苗设计与研究的全部知识产权,具有一定的产业化前景。 本成果目前已经发表相关论著20余篇,收录到本成果15篇,其中SCI论著2篇;据不完全统计,这些论著被SCI、Medline、CA、BA、CSCI等收录或引用约100余篇次。 存在的问题与改进的措施： 1.本项目需要在体内实验进一步深入研究,与体外实验的结果相互参比,得到验证。 2.本项目DC疫苗及RNA疫苗抗肿瘤作用的分子机制有待于深入研究。