[01215293]胆道炎症诱导胆管细胞miRNA网络失衡参与肝内胆管结石形成特征分析及大黄灵仙胶囊的调节效应

①课题来源与背景 原发性肝胆管结石（hepatolithiasis,HL）是我国常见的良性胆道疾病,长期反复发作的胆管炎症是最主要的病理过程,胆汁性肝硬化和胆管细胞癌是疾病反复进展的最终结局。学术界近年来对肝内胆管结石的发病机制做了相当深入地研究,临床上仍缺乏有效的治疗药物,对症治疗仍是当前主要治疗手段,外科手术是对症治疗的不二选择,但手术治疗后部分病人肝内胆管结石仍不可避免的复发,此类病人不得不再进行次手术或者多次手术,无疑将加重患者的身心痛苦和经济负担。课题组尝试从中医药宝库中筛选出有效的中药方剂,以降低患者术后肝内胆管结石复发率,为本病的临床治疗提供新的解决思路,经过近 10 年的不懈努力,从理论构建到方药筛选,再到疗效验证和初步机制研究,最终形成了能有效防治肝内胆管结石的中药复方—大黄灵仙胶囊,并尝试探明其效应机制。 ②研究目的与意义 从胆管细胞内源性 miRNA网络层面阐明原发性肝内胆管结石的成石机制;从调控胆管细胞miRNA表达角度,揭示大黄灵仙胶囊治疗原发性肝内胆管的科学依据,为进一步推广应用夯实基础 ③主要论点与论据 1.构建兔胆石症动物模型确定大黄灵仙胶囊的整体疗效,证实其有缓解肝损伤,恢复肝功能的效用成功构建兔胆石症动物模型,研究发现,与正常对照组比较,模型组肝功能指标均有明显升高,超微病理显示大黄灵仙胶囊可以明显减轻结石对肝脏的损伤,修复受损肝细胞,促使其结构和功能的恢复,同时可以减少肝脏纤维化的形成,减缓或阻断假小叶的生成,维持肝组织的正常生理结构。说明大黄灵仙胶囊有缓解肝损伤,恢复肝功能的效用。 2.构建胆管细胞炎症应激模型确定大黄灵仙胶囊细胞实验给药浓度,并明确了大黄灵仙胶囊可以缓解胆管细胞炎性应激课题组发现LPS（5ug/ml）+DHLX（1mg/ml）的浓度组合胆管细胞增殖效率维持在95%,明显高于其他剂量组合,确定DHLX 1mg/ml 的配置浓度是直接胆管细胞炎性实验（LPS 5ug/ml）的较佳浓度。同时为检测 DHLX 对胆管细胞炎性应激的影响,课题组采用 PCR 技术分别测定各组胆管细胞IL-6及TNF-α mRNA表达情况。结果提示胆管细胞 IL-6 及 TNF-α mRNA 表达在 LPS 刺激后显著增高,DHLX 干预处理胆管细胞后 IL-6 及 TNF-αmRNA表达明显受到抑制,以此推测DHLX 可缓解胆管细胞炎性应激反应。 3.通过胆管细胞 miRNA 芯片检测及生物信息分析,初步探明大黄灵仙胶囊调控胆管细胞炎性反应的机制项目组以差异表达变化超过 1.5 倍,P＜0.05为标准,筛选胆管细胞炎性应激条件下大黄灵仙胶囊可调控的 miRNAs。大黄灵仙胶囊可在胆管细胞炎性条件下,调控30个 miRNAs 表达。通过靶基因GO分析和KEGG PATHAY富集分析,课题组发现大黄灵仙胶囊可影响胆管细胞信号转导、有机化合物反应及缺氧应激等生物学过程,在调节细胞质、内质网及膜筏等细胞组份,调控信号转导活性、转录调控区的 DNA 结合及电压门控钾通道活性等发挥分子生物功能。大黄灵仙胶囊可在胆管细胞炎性条件下调控cAMP、cGMP-PKG、HIF-1及TNF-α等众多信号通路,参与调控胆管细胞炎性反应的调控。 4.通过对大黄灵仙胶囊可能调控的 miRNA 及 mRNA 表达量验证,证实大黄灵仙胶囊可通过降低炎性因子表达,影响胆管细胞炎性反应进程项目组采用 qRT-PCR 对有文献报道的 miR-140-5p、miR-152-3p、miR-221-3p 及 miR-30b-3p 表达进行验证,结果显示大黄灵仙胶囊在胆管细胞炎性条件下可对 miR-140-5p、miR-152-3p、miR-221-3p 及miR-30b-3p 的表达进行调控,经大黄灵仙胶囊治疗后,可显著降低炎性因子表达,影响胆管细胞炎性反应进程。 5.构建大鼠胆道炎症模型,确定大黄灵仙胶囊的整体疗效及验证关键miRNA表达 为印证细胞实验及RNA芯片分析所得出的大黄灵仙胶囊效应miRNA及其靶基因表达,构建大鼠胆道感染模型在动物水平上再次检测miR-140-5p、miR-152-3p、miR-221-3p及 miR-30b-3p表达,证实大黄灵仙胶囊在胆管细胞炎性条件下可对 miR-140-5p、miR-152-3p、miR-221-3p及 miR-30b-3p的表达进行调控。 6.挑选 miR-152-3p 完成 RNA 干扰实验文献研究发现肝内胆管结石与胆管 EMT 存在关联,而miR-152-3p 与 EMT 进程及组织纤维化关系密切,实验结果证明大黄灵仙胶囊可通过上调 miR-152-3p 表达,增加下游靶基因 E-Cad 表达,降低Zeb1 表达;使用miR-152-3p inhibitor后大黄灵仙胶囊对 E-Cad 及 Zeb1 的影响作用被逆转。证实大黄灵仙胶囊可通过调控miR-152-3p 延缓炎性胆管组织 EMT 进程,从而缓解持续炎症导致的胆道病理性重塑。 ④创见与创新 直接着眼于胆管细胞 miRNA 调控网络,明确该网络失衡致胆管内结石形成特征是本项目的创新之一;将大黄灵仙胶囊的效应机制深入到调控胆管细胞内源性 miRNA 表达层面,是本项目的创新之二;针对西医治疗难点,结合医学研究前沿阐明中医特色优势方药的疗效机制,是本项目创新之三。 ⑤社会经济效益; 大黄灵仙胶囊被广泛运用于临床治疗原发性肝内胆管结石及术后复发和预防,并取得了明显疗效,可有 效减少结石、预防复发,未见不良反应及副作用,改善了患者的生存质量,促进和推动中医药的生产与发展,取得了良好的社会经济效益 ⑥历年获奖情况 1.唐乾利、赫军、王清坚、黄名威、刘祖军、覃振林、俞渊、庞国栋、狄钾骐,基于肝胆同病理论防治胆石病的基础与临床应用研究,广西壮族自治区人民政府,广西 科技进步奖,二等奖（证书号：2012-J-2-031-07）,2012 2.唐乾利、赫军、黄名威、俞渊、王清坚、廖冬燕、黄炜、陆世锋、黄小明、周薇,大黄灵仙胶囊降低胆石症术后残石率及复发率的临床研究,获 2010 年度中华中医药学会科学技术奖二等奖（中华中医药学会,证书号：201002-11 LC-06-R-05）,2010 ⑦存在的问题无。