[01215002]基于磁珠与液质联用技术的青娥方雌激素样作用物质基础研究

1. 课题来源与背景： 植物雌激素具有雌激素样、抗肿瘤、心血管保护、抗老年痴呆等作用,特别是在更年期症状改善方面具有明显优势,能够克服雌激素临床应用的局限性。植物雌激素的筛选方法主要有动物实验法、E-SCREEN法、报告基因法、配体结合法等,但这些方法存在一定的局限性,例如筛选周期长,限制了其在中药复杂体系活性成分筛选方面的应用。 本课题针对中药复方复杂体系药效物质基础研究中存在的问题,以经典名方青娥方为研究对象,整合血清药物化学、亲和质谱、雌激素样活性高通量筛选技术以及雌激素活性评价方法,从青娥方体外化学成分群、体内化学成分群以及主要成分的雌激素活性研究三个层次,辨析青娥方雌激素样作用的物质基础研究。 2. 研究目的与意义： 植物雌激素是一类天然来源的结构与内源性雌激素相似的化合物,能够模拟雌激素在人体内的理化作用,对更年期综合征、绝经后骨质疏松、肿瘤、心血管疾病等有独特的预防和治疗功效。本项目建立的方法可以快速的从中药复方中筛选潜在的植物雌激素,并可将此方法推广到中药复方中与靶蛋白结合发挥作用的活性化合物的快速筛选,为中药药效物质基础研究提供了一种新思路。本项目的研究不仅对于阐明经典名方青娥方的药效物质基础具有重要意义,同时也为青娥方现代制剂的深入开发提供了一定的科学依据和技术支持。 3. 主要研究内容： 1)青娥方体内外化学成分群的研究 采用HPLC-IT-TOF/MS技术,对青娥方的各类化学成分群的质谱裂解规律和诊断碎片离子进行研究,阐明青娥方的体外化学成分群。基于血清药物化学,对灌胃青娥方的大鼠血清样品进行分析,阐明青娥方的体内化学成分群。 2)基于亲和质谱技术的青娥方雌激素样活性化合物快速筛选方法的建立及验证 基于亲和质谱技术建立从中药复方青娥方中快速筛选雌激素受体潜在配体化合物的方法,并对筛选出的候选化合物运用Protein Thermal Shift Assay以及表面等离子共振实验（SPR）进行进一步验证,定位青娥方中最可能具有雌激素样活性的目标化合物。 3)配体化合物雌激素样活性的研究 采用乳腺癌细胞MCF-7增殖实验（E-SCREEN）,研究筛选出的配体化合物的雌激素样活性,验证已建立的筛选方法的可靠性。 4. 创新点： 1)本课题基于受体-配体理论,建立基于分子预测和细胞验证层级递进的快速、高通量活性化合物筛选体系,并成功将其应用于青娥方雌激素样活性物质的研究,为中药药效物质研究提供了新方法。 2)首次将亲和质谱技术应用于植物雌激素样活性化合物筛选,直接从中药复方提取物中鉴别活性化合物,可以快速追踪目标活性成分,进而指导化合物的分离纯化,进一步研究和探索中药复方的活性物质。 5. 项目取得的成果： 本项目主要的研究成果包括：第一,阐明了传统经典名方青娥方的体内外化学物质基础,为青娥方的相关后续研究奠定了基础;第二,阐明了青娥方发挥雌激素样作用的物质基础,为青娥方现代制剂的深入开发提供了一定的科学依据和技术支持;第三,建立的基于亲和质谱的青娥方雌激素样活性快速筛选方法,不仅可应用于其他中药的雌激素样活性研究中,而且可将此方法推广到中药或复方中与靶蛋白结合发挥作用的活性化合物的快速筛选,为中药药效物质基础研究提供了一种新思路。 本项目的相关研究成果已在SCI期刊上发表了3篇学术论文,1篇中文核心期刊论文,另有1篇中文核心期刊论文已被正式录用,1篇论文正在准备投稿中;申请发明专利2项。共培养3名硕士研究生,项目负责人在项目执行期间入选天津市“131”创新型人才培养工程第三层次人选。