[01214122]动物疫苗昆虫生物反应器关键技术研究与应用

1、解决的关键技术与创新点 本项目通过建立新的高水平表达重组蛋白昆虫细胞表达系统,掌握高效昆虫细胞表达系统构建和重组蛋白表达技术,开展无血清培养昆虫细胞的关键技术研究,应用于研制高效、环保、低成本的动物用基因工程亚单位疫苗,属于国家中长期科技发展纲要支持的重点。 2、取得的技术指标 （1）在已经产业化的蛋白高效表达High Five细胞系（BTI-Tn-5B1-4）的基础上,成功克隆出8个克隆株,通过克隆进一步优化了细胞性状的均一性。用杆状病毒P35基因改造昆虫细胞,提高细胞抗凋亡能力。 （2）对昆虫细胞BTI-Tn-5B1-4和Sf-9进行无血清驯化,研发出培养昆虫细胞的基础的无血清培养基配方。进行添加植物蛋白水解物来代替胎牛血清的补充试验研究。 （3）改造杆状病毒基因组,删除导致重组蛋白降解的蛋白酶基因,减轻和降低重组蛋白的降解,保证外源基因表达产物的稳定,提高BEVS系统的表达效率。进行合理调控目的基因的转录实验研究,提高转录水平,从而提高重组蛋白的翻译水平。优化启动子类型,提高外源基因的表达。构建非洲猪瘟病毒P30基因、猪圆环病毒2型Cap蛋白基因的重组杆状病毒载体并在昆虫细胞中表达和鉴定,建立了猪圆环病毒2型的ELISA抗体间接检测方法。 （4）申报国家专利4项,其中申请国家发明专利2项,授权国家发明专利2项。发表论文7篇,其中SCI收录2篇,中文核心期刊5篇,培养研究生3名。 3、经济和社会效益 课题组构建了非洲猪瘟病毒P30基因、猪圆环病毒2型Cap蛋白基因的重组杆状病毒载体并在昆虫细胞中表达和鉴定,建立了猪圆环病毒2型的ELISA抗体间接检测方法,为非洲猪瘟相应的血清学检测方法的建立,基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础,将对于防止非洲猪瘟侵入我国,猪圆环病毒病的防治,保障我国生猪养殖业的健康发展具有十分重要的现实意义。 4、取得的论文、标准、专利、著作等成果 发表学术论文7篇,其中SCI收录论文2篇。 [1] 刘晓东,张福波,Bin Zhou,单虎*,陈溥言*.Effect of sonication on different quality parameters of Pinus massoniana pollen [J]. Ultrasonics Sonochemistry.2015,22:174–181. [2] 刘晓东*,张福波,单虎*,王述柏. mRNA expression in different developmental stages of the chicken bursa of Fabricius[J]. Poultry Science. 2016,Accepted January 31. [3] 黄娟,任颖超,张玉凤,单虎. 猪繁殖与呼吸综合征病毒新结构蛋白基因ORF5a分子特征[J]. 中国兽医杂志,2016,02: 12-14. [4] 黄娟*,袁飞* ,韩先杰,李桂梅,单虎**.猪圆环病毒2d亚型衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达[J]. 农业生物技术学报,2016,09: 1346-1353. [5] 秦晓冰,孙伟博,单虎. PCV-2-1B的分离鉴定及感染性克隆的初步构建[J].黑龙江畜牧兽医,2016.19: 178-181. [6] 任颖超,黄娟,单虎. PRRSV变异株ORF5全基因的可溶性表达与重组蛋白的纯化[J].中国兽医杂志,2016.04：30-32. [7]史一珺,宋晓明,于忠伟,张洪亮,焦绪娜,黄娟,单虎.不同宿主来源犬瘟热病毒H基因的克隆测序与分析[J].中国兽医杂志,2016.12：31-34。