[01208935]高产琥珀酸重组大肠杆菌的构建及工业化关键技术的研究

该项目由湖北工业大学引进高层次人才科研基金资助,总经费为25万元。 传统的琥珀酸生产是以不可再生战略资源石油为原料,而目前石油储量在不断减少,价格在不断增长,并且石油工业对环境有很大的负面影响,这促使了琥珀酸生物合成工业的研究和发展。采用微生物发酵法生产琥珀酸,由于其利用可再生资源,原料来源广泛,价格低廉,污染小,并且在发酵过程中可以固定CO2,具有很好的应用前景,近年来引起研究者的广泛关注。通过发酵法生产的琥珀酸,价格约为0.55～1.10美元/kg,使得琥珀酸衍生物1,4-丁二醇等可以和石油化学产品在生产成本上形成竞争。利用Red重组系统和位点特异性重组技术,无痕敲除了野生型大肠杆菌染色体上的ldhA、adhE、pflB、poxB、ackA、mgsA、aspC和sfcA基因,结合进化代谢育种技术,筛选获得低盐条件下可高产琥珀酸非转基因大肠杆菌工程菌。所得菌株可利用NBS培养基和AM1低盐培养基,其成分主要为多种无机盐,成本远低于LB培养基;并且可以高效转化工业废弃玉米浆和葡萄糖结晶废糖液,目前在国内外尚属首例。所获得的工程菌,可在厌氧条件下发酵,48 h后琥珀酸产量达到92 g/L,糖酸转化率为89%,无杂酸生成。 （1） 技术优势：利用Red重组系统和位点特异性重组技术,无痕敲除了野生型大肠杆菌染色体上的ldhA、adhE、pflB、poxB、ackA、mgsA、aspC和sfcA基因,结合进化代谢育种技术,筛选获得低盐条件下可高产琥珀酸非转基因大肠杆菌工程菌。后3个基因为国内首次敲除成功。 （2） 工艺特色：目前报道的大多数产量较高的大肠杆菌工程菌一般都通过质粒过量表达了异源基因,本研究所构建的基因工程菌没有过表达异源基因,因此不携带外源质粒,在发酵过程中不需要添加抗生素（Kan、Amp、Cam等）和诱导剂（IPTG）,简化了发酵流程。已完成工业实验,适用于工业发酵及石油化工行业。此技术已分别在武汉三江航天固德有限公司和山东潍坊盛泰药业有限公司进行工业化试验生产,在为公司带来利润的同时,我们也发现了我们自己的不足：所构建菌株的发酵温度为37度左右,在节约能源的同时,不能有效的杜绝杂菌的污染。