[01205992]蛋白导向印迹自组装单层膜的构筑及其识别检测C–反应蛋白

课题来源与背景： 许多蛋白是疾病标志物和治疗靶标,抗体更是在生物研究和疾病诊疗方面起到非常重要的作用,但是抗体价格昂贵、结构易变,并且不能循环利用。分子印迹是制备对某一特定分子具有空间结构选择性识别能力的聚合物的技术。这种技术通常被人们描述为创造与识别“人工钥匙”的“人工锁”技术。蛋白分子印迹制备人工抗体,显示优异的化学、力学和热稳定性,能够代替昂贵的生物抗体,用于蛋白分离和提取以及生物传感,是一种非常具有前景的既经济、稳定,又可循环利用的人工生物材料。 相对于传统体相印迹方法,印迹单层膜具有两方面优势,比如模板分子进出印迹孔穴时具有优良传质,这对于蛋白等较大的模板分子非常重要。另一方面,模板分子重新结合通常较快,印迹单层膜有利于分子结合信号转导实时检测,进一步增强生物传感性能。 研究目的与意义： C-反应蛋白（CRP）产生于肝脏,可以引发对侵入细胞的免疫调理作用和吞噬作用。发生炎症时,血清中CRP浓度急剧升高,CRP已经作为健康的一个一般标记物。基于带酰胺的分子（DHAP）在形成蛋白印迹膜时具有的优点,并结合CRP和磷酸胆碱较高的结合亲和性和明确的多键结构,用CRP、DHAP和磷酸胆碱构建CRP单层印迹膜,用于靶向CRP的灵敏和无标记检测。然而在合成磷酸胆碱为端基的短链硫醇分子时,由于作为反应物的短链硫醇分子往往以气体状态存在,并且容易氧化,多次尝试,合成产物经核磁谱表征,并非我们预期的分子结构。所以,我们利用合成的DHAP分子和商品化的功能小分子,研究了糖蛋白印迹材料。许多糖蛋白是疾病生物标记和治疗靶标。所以,糖蛋白印迹材料制备非常重要。 荧光碳点（CND）是碳纳米材料家族的新成员,相比于传统的半导体量子点和有机染料,CND具有水溶性好、化学性质稳定、易功能化、耐光漂白、低毒和生物相容性良好等优点。目前的研究主要集中在寻找一种更有效、更简单的制备技术和利用CND荧光特性的有效方法。在生命科学领域,CND已开始取代生物毒性的量子点,用于生物成像、生化检测和药物传递,是疾病诊断应用领域最有前途的荧光纳米材料之一。 主要论点与论据： 我们用电化学方法研究了在金电极表面组装的二元单层自组装膜（SAM）(巯基苯硼酸（PMBA）与对氨基苯硫酚（PATP）、以及与模板蛋白乳铁蛋白（Lac）或辣根过氧化物酶（HRP）的相互作用,然后用合成的DHAP分子与PMBA、PATP、和Lac按一定比例混合,共组装在电极表面,最后修饰电极放入酸性介质溶液中,除去模板蛋白,构筑糖蛋白印迹SAM。然后用电化学方法（CV、EIS、DPV）,对自组装膜进行了表征,结果表明,构筑的糖蛋白印迹SAM对模板Lac（或HRP）发生明显识别响应,选择HRP、Mb和BHb作对比,对非模板蛋白的响应较小,HRP为糖蛋白,能与印迹位点中的硼酸结合,在三个非模板蛋白中变化幅度相对较大,这些结果证实印迹SAM含有能特异识别模板蛋白的结合位点。 我们使用L-谷氨酸作为碳源,利用加热回流方法快速合成了荧光碳点,此荧光材料近似球形,粒径大约5.4nm,量子产率大约6.3%。其荧光性质具有明显的激发光依赖性,以及良好的温度敏感性。另外,此荧光碳点不仅能被CT26.WT 和CAL-27细胞吞噬,而且具有低毒性和生物相容性,可以作为细胞成像研究的材料之一。 使用柠檬酸氢二胺作为碳源,利用一步微波辐照方法,快速制备了N掺杂的荧光碳纳米材料,这种荧光材料呈球形,具有较高的荧光量子产率,约26.8%,它高于大部分用其它微波方法制备的碳纳米材料。另外,此种荧光碳纳米材料能够有效被BGC-823和CT26.WT细胞吞噬,具有低的细胞毒性和良好的生物相容性,非常适于细胞成像研究。同时,制备的荧光碳点能够用于Fe3+的灵敏检测,检测限达到180 nM。另外,我们合成了Ag@SiO2核壳纳米粒子,并与CND偶联,通过优化氧化硅壳层厚度获得最大荧光强度,制备了双功能CND修饰的Ag@SiO2纳米复合粒子。 创见与创新： 构筑的糖蛋白印迹自组装单层膜有一定的靶向蛋白识别能力,对构建糖蛋白表面印迹材料具有一定的指导意义。制备的荧光碳点可用于细胞成像标记,双功能碳点修饰的Ag@SiO2纳米复合粒子可用于高灵敏荧光和SERS免疫检测,此新型复合材料在生物检测和生物成像领域具有潜在应用前景。 社会经济效益,存在的问题： 本成果主要围绕蛋白印迹自组装单层膜的构建展开,在研究过程中,提出了糖蛋白印迹自组装单层膜的构建方法、一种利用加热手段或微波辐照制备荧光碳点的方法。这些功能材料主要应用在蛋白检测、细胞标记等领域。存在的问题主要是产品制备还处于实验室微型化、小批量阶段,若要将成果转化,扩大应用,需要对材料的制备放大实验继续进一步研究。