[01193871]构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作系统的研究

(1)任务来源 河南省教育厅科学技术研究重点项目指导计划（14B23003）和河南科技学院高层次人才引进支持计划,经费共计6万元。 （2）应用领域和技术原理 本课题属于畜牧兽医学科预防兽医学领域的研究内容。 2006年初,我国南方猪群中暴发以发病急、传播快、高发病率和死亡率等为特征的高致病性PRRS （High pathogenic PRRS,HP-PRRS ）,给我国养猪业带来了难以估量的经济损失。中华人民共和国农业部公告第1125号规定,HP-PRRS为一类动物疫病,世界动物卫生组织（OIE）也将其列为法定报告动物疫病。 （3）性能指标 1. pSK-CMV载体的构建。通过对PRRSV XX-2012株全基因组序列和CMV真核启动子序列的分析,成功获得克隆质粒为pSK-CMV。 2. XX-2012株PRRSV全长cDNA克隆的构建。通过对XX2012株PRRSV进行RNA抽提,cDNA合成,成功获得XX2012株PRRSV全基因组序列。将扩增得到的各片段PCR产物,按酶切位点对每个PCR片段进行酶切后连入pSK-CMV载体,将各个片段通过相应的酶切位点逐一连接,最终获得含有XX-2012株PRRSV全长基因组cDNA的质粒。阳性质粒命名为pSK- XX-2012。 3. pSK-XX-2012转染MARC-145细胞。将全长质粒pSK-XX-2012在MARC-145细胞在转染后约60 h收取转染细胞,反复冻融三次,12,000rpm离心2min,去除细胞碎片,获得的细胞上清液即为拯救病毒液。将获得的拯救病毒命名为rXX-2012。 4.拯救病毒的体外传代。在感染前一天,将状态良好的MARC-145细胞接种于细胞瓶中,约12h后细胞融合度达到80%～90%,进行感染病毒的接种传代。拯救病毒与亲代病毒具有相似的生物学特征（间接免疫荧光,半数致死量以及生长曲线）,且拯救病毒具有独特含有特殊的分子标签。 （4）与国内外同类技术比较 在PRRSV反向遗传操作系统的构建过程中,早期的研究是将含有PRRSV基因组全长cDNA的克隆置于原核转录启动子（如：噬菌体 T7、SP6 启动子）下建立病毒的拯救体系,这样的设计在操作上存在很多的局限性。本实验感染性克隆的构建方法则是将PPRSV基因组全长cDNA的克隆置于真核启动子CMV下,在病毒的拯救过程中直接将构建好的阳性质粒转染至MARC-145细胞,通过宿主细胞自身的转录酶系统在细胞内转录出PRRSV全基因组RNA,进而翻译出病毒所需的全部蛋白,并最终拯救出病毒。 （5）成果的创新性和先进性 本研究采用真核启动子构建高致病性PRRSV,采取这样的病毒拯救方法不仅能缩短病毒拯救的时间,同时也降低了病毒拯救的成本。经河南省农业科学院科技信息研究所查新表明,本研究成果在国内未见其他报道。因此本项研究成果在国内具有领先地位。