[01181637]作物细菌人工染色体文库构建新方法及其应用

1．任务来源973计划（2004CB117306）、国家自然科学基金（30270848）、教育部科学技术研究重点项目（204017）、国家留学基金。2．应用领域和技术原理（1）应用领域：农业科学技术领域（2）技术原理BAC文库是深入开展图位克隆、物理图谱构建、基因组测序、基因结构和功能分析的重要基因组资源。通过研究non-gridded BAC文库构建过程中一些关键因素，建立基因组较大的作物non-gridded BAC文库构建新方法，确定BAC亚库所含的克隆数和克隆复苏培养时间，明确连接产物和克隆保存过程中的关键影响因素；non-gridded和gridded方法相结合，构建具有不同优良性状棉花品种的BAC文库；利用探针杂交或菌液PCR技术，筛选重要性状相关基因的目标BAC克隆；利用近着丝粒分子标记、染色体末端分子标记和荧光原位杂交（BAC-FISH）技术，筛选获得四倍体海岛棉的着丝粒和端粒探针。研究结果对于克隆重要基因、研究棉属着丝粒、端粒的序列组成和功能、发掘分子标记、深入开展棉花功能和比较基因组学研究等具有重要意义和应用前景。3．性能指标（1）合同书要求的性能指标以我国著名的抗病、高产、优质棉花品种中棉所12号、高强纤维种质系7235、抗病优质海岛棉品种Pima90-53为材料，采用non-gridded BAC文库新方法，分别构建BAC文库。文库包含的BAC克隆总数目在20万以上，供创建含有500个BAC的文库池400个（BAC pools），每个品种的文库覆盖3倍以上的基因组，克隆片段平均在120kb以上。利用已经发表的棉花纤维发育相关基因片段或棉花连锁图谱分子标记为探针，钓取含有相应标记的BAC克隆，进行相关基因克隆或发掘SSR、SNP标记的初步研究。预期取得国际先进水平的成果，构建出我国第一批陆地棉大片段BAC文库；在国内一级学报或国际学术刊物发表论文3－5篇，培养研究生2－3名。（2）实际达到的性能指标全部完成了合同书计划内容。构建了我国高产优质抗病陆地棉品种中棉所12号、高纤维强力棉花种质系苏远7235和抗病优质海岛棉品种Pima90-53的拥有自主知识产权的BAC文库，包括中棉所12号和Pima90-53的non-gridded BAC文库（每个亚库包含400-600个克隆，共计410个亚库）和3个棉花品种的单克隆BAC文库（共含有236560个克隆，平均覆盖3.6倍基因组，插入片段平均大于120kb）。从海岛棉BAC文库中筛选获得了和棉纤维发育、黄萎病抗性相关的目标BAC克隆，为这些重要性状的基因克隆奠定了基础。此外，利用近着丝粒分子标记、染色体末端分子标记和荧光原位杂交（BAC-FISH）技术，从Pima90-53 BAC文库中筛选获得异源四倍体棉种海岛棉D亚组染色体着丝粒探针和含有端粒序列的BAC克隆，为研究棉属着丝粒、端粒的序列组成和功能奠定了基础。4．与国内外同类技术比较根据国内外相关文献和数据库检索，本研究与国内外同类技术相比较：（1）Non-gridded BAC文库构建新方法具有新颖性Non-gridded BAC文库构建新方法属首次报道。之后，陈凡国等（2002）、刘越等（2006）报道利用本研究发表的方法，分别构建了野生一粒小麦和矮败－中国春小麦的BAC文库。除此之外，未见其他报道。（2）海岛棉细菌人工染色体（BAC）文库构建具有新颖性国内外先后构建了水稻（陈琪等，2007）、药用野生稻（阿新祥等，2005）、高梁、拟南芥、甘蔗、大豆、小麦、大麦、马铃薯、珍珠粟、柑橘、咖啡树、鹰嘴豆等作物的BAC文库（王省芬等，2002）。在棉花上，Tomkins等（2001）报道了陆地棉BAC文库的构建。而关于海岛棉BAC文库的构建，未见研究报道。（3）棉花抗黄萎病和纤维品质发育相关基因的目标BAC克隆筛选的研究具有新颖性除本研究外，Tomkins等（2001）利用构建的陆地棉BAC文库，开展了与纤维发育相关基因克隆的鉴定研究。未见其他报道。（4）海岛棉染色体着丝粒探针和含有端粒序列的BAC克隆筛选的研究具有新颖性在其他作物上，有利用BAC文库开展着丝粒序列的研究报道。陈凡国等（2003）利用野生一粒小麦BAC文库，以水稻着丝粒重复序列RCS1为探针，筛选获得一些阳性克隆，进而克隆了野生一粒小麦TBRCS1着丝粒重复序列。裔传灯等（2007）通过构建5个稻属二倍体野生种的基因组BAC文库，采用菌落杂交和FISH技术，筛选和鉴定了各染色体组着丝粒克隆。在棉花上未见相关报道。5．成果的创造性、先进性（1）首次提出并建立了基因组较大的作物non-gridded BAC文库构建新方法，确定了BAC亚库包含的最适克隆数和克隆复苏培养的时间，明确了连接产物和克隆保存过程中的关键影响因素。（2）构建了我国高产优质抗病陆地棉品种中棉所12号、高纤维强力棉花种质系苏远7235和抗病优质海岛棉品种Pima90-53的拥有自主知识产权的3个BAC文库，其中海岛棉BAC文库为首次报道。（3）从抗病优质海岛棉Pima90-53 BAC文库中筛选到一些与棉花抗黄萎病和纤维品质发育相关基因的目标BAC克隆，为这些重要性状的基因克隆奠定了基础。（4）从海岛棉BAC文库中筛选获得异源四倍体棉种海岛棉D亚组染色体着丝粒探针和含有端粒序列的BAC克隆，为研究棉属着丝粒、端粒的序列组成和功能奠定了基础。6．作用意义（直接经济效益和社会意义）本项目建立的non-gridded BAC文库构建新方法，为基因组较大的作物构建BAC文库资源平台提供了重要的技术支撑。构建的3个棉花BAC文库为深入开展棉花基因组学和功能基因组学研究提供了重要的资源材料，填补了国内棉花BAC文库的空白。从海岛棉BAC文库中筛选出的棉纤维发育和抗黄萎病相关基因片段的BAC克隆，为这些重要性状的基因克隆奠定了基础。从海岛棉BAC文库中筛选获得的异源四倍体棉种海岛棉D亚组染色体着丝粒探针和含有端粒序列的BAC克隆，为研究棉属着丝粒、端粒的序列组成和功能奠定了基础。上海交通大学利用本项目构建的BAC文库正在开展棉花抗黄萎病基因克隆等相关的一些研究工作。构建的棉花BAC文库，列入ICGI棉花基因组计划白皮书。本项目的实施带动了中国农业科学院（棉花、小麦）、内蒙古农业大学动物遗传学科（山羊）、河北农业大学作物遗传育种学科（玉米、大白菜）、植物病理学科（小麦抗病系、马铃薯晚疫病菌）BAC文库构建的开展，为这些研究的顺利进行提供了技术支持。7．推广应用的范围、条件和前景以及存在的问题和改进意见该成果应用范围为棉花分子生物学、基因组学、功能基因组学的基础和应用研究等领域，有着较为广阔的应用前景。应用单位可以直接向河北农业大学棉花遗传育种研究室索取论文、BAC文库构建方法、棉花BAC文库和着丝粒、端粒探针。需要加以改进的方面：要加强对棉花BAC文库的利用研究，如利用代表性分子标记筛选本研究获得的BAC文库，确立覆盖不同连锁群的候选BAC克隆，为开发新的分子标记、基因组测序提供依据；或筛选、获得重要性状相关基因或基因片段的候选克隆，为全基因及其相关调控元件的研究提供依据等。