[01164756]用DNA家族Shuffling重组新型人干扰素α

重组人干扰素α是病毒感染和恶性肿瘤的重要治疗药物，临床用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎、生殖器疣及疱疹等病毒性疾病，毛细胞白血病、粒细胞白细胞、骨髓瘤等各种恶性肿瘤。然而，由于半衰期短，产生结合抗体和中和抗体，使得临床治疗效果不够理想。同时，在重组人干扰素的工业化生产中，形成包涵体，需要变性、复性等复杂工艺，增加了生产成本，降低了生物活性。为了克服这些不足和缺陷，提高疗效，本项目开展了干扰素α的创新及其工艺研究。本项目采用现代生物技术、生物信息学技术和药理学技术与方法，计算机辅助设计突变分子，进行聚合酶链式反应(PCR)，定向精确突变相应位点，筛选高比活性突变体，取得以下主要成果： 1.创造性开发成功一种组合多位点突变方法，在一个试管内由三阶段PCR完成。在第一阶段，扩增多位点突变的大引物，使邻近12～15个碱基内的基因发生突变。然后在第二阶段大引物被延伸，在第三阶段形成全长突变序列。该方法的特点是基于退火温度和热循环参数进行组合大引物反应，实现定向多点和相邻突变，而且在三阶段PCR中，退火温度的差异小（在10C以下）。该方法操作简单而且突变效率高，突变体为100%。此方法新颖，未见相同的报道和专利。 2.成功应用重叠延伸方法对相隔较远的单个位点进行突变改造。为了保证较高的诱变效率，在突变位点两侧要有8个以上的碱基进行保护，设计合理的两条长引物(27～35bp)，经过两轮三次扩增反应，获得单个位点突变的干扰素基因。 3.采用以上两种策略和方法，选择性将干扰素受体结合区域和活性位点的氨基酸残基进行置换，对10个活性位点进行定点突变，成功地获得了6个干扰素突变体。其中最好的突变体的抗病毒活性比原型干扰素提高92倍。新型重组人干扰素α2b有效地组合了位点效应，其生物活性提高了近百倍。 4.建立了重组人干扰素的大肠杆菌高效表达系统。对SD序列设计和优化，解除了内部的稀有密码和类SD序列对翻译的干扰，构建了高效表达载体。优化了发酵工艺条件，在30℃，1mM的IPTG诱导5h，表达最大，重组人干扰素占总蛋白质的30%以上。与文献比对，达到了国际先进水平。 5.实现了重组人干扰素的可溶性表达。本研究筛选到一种硫氧化还原酶，与干扰素融合表达，帮助干扰素的折叠，成功表达出可溶性干扰素。在30℃、0.5mM的IPTG诱导5h，可溶性重组人干扰素占干扰素蛋白的67%以上。与文献比对，达到了国际领先水平。 本项目的研究成果将在生物技术、分子生物学研究和医药（抗病毒、抗肿瘤）领域等得到应用。新型高活性重组人干扰素比原型干扰素提高了近百倍，将在替代原型干扰素的低活性方面展示良好的应用前景。本项目建立的高效表达系统和可溶性表达系统，完全可用于目前重组人干扰素的工业化生产工艺的改造中，同时，可应用到其他蛋白质药物或酶制剂等的工业化生产中。本项目发明组合大引物多位点突变技术，可广泛用于蛋白质、酶活性改造等生物技术领域，基因和蛋白质结构与功能研究的分子生物学领域。