[01161503]广西特色中草药匙羹藤总皂苷提取工艺及生物活性的研究

1．项目研究的背景及意义。 匙羹藤系萝摩科匙羹藤属植物,又称羊角藤,分布于印度,非洲及我国的两广。该植物的化学成分主要有皂苷类、甾醇类、多肽、果胶、黄酮、生物碱以及铜等微量元素等,其降血糖的活性成分主要是一系列的三萜皂苷类化合物－匙羹藤酸（Gymnemic acids,简称GA） ,它的降血糖、降血脂作用国内外研究很多,而抗衰老研究方面较少,本项目通过抗衰老药物的生物化学研究方法,用三种抗氧化体系综合评价匙羹藤中三萜皂苷类化合物的抗氧化活性。从而预测其对人体抗氧化作用的功效。为其做为功能性食品添加剂的开发利用提供科学依据及开发前景。 中草药的化学成分十分复杂,含有多种有效成分,提取其有效成分并进一步加以分离、纯化,得到有效单体是中药研究领域中的一项重要内容。从天然产物中分离有效成分并发展新药和寻找先导化合物是药物开发的重要内容。要能够有效地提取中草药的有效成分,就必须用各种有效手段来破坏或降解中草药纤维素、果胶质等细胞壁和细胞间结构,然后是尽量降解细胞内的非药物成分,比如蛋白质、核酸残余物等。为了提高治疗效果,就要最大限度提取有效成分并去除或降低杂质及有毒成分。一般来说,中药药理活性成分的含量一般较低,传统提取方法（煎煮法、回流法、浸渍法、渗滤法等）在提取过程中很难选择性进行提取, 存在着有效成分损失大、时间长、工序多、有机溶剂用量大、提取收率低等缺点,浪费大量宝贵的药材资源。近年来,许多学者从不同角度对中药提取工艺进行摸索和优化,逐步实现中药提取的科学化、规范化和标准化,使得它们能针对不同的活性成分进行选择性提取。这样一方面使中药生产更加符合传统的中医药理论,确保用药的质量要求,另一方面也提高了现有植物资源的利用率。 生物酶解技术作为一项新的提取技术,在选择性、工作效率、节能和环保方面具有明显的优越性,它无需特殊设备,完全适用于工业化生产,具有极大的应用前景。酶法提取是根据植物细胞壁的结构,利用酶反应具有高度专一性的特点,选择相应的酶,将细胞壁的组成成分（纤维素、半纤维素和果胶质）水解或降解,破坏细胞壁结构,使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中,从而达到提取的目的。目前从匙羹藤中提取三萜皂苷类化合物工艺大多采用乙醇回流提取我们从提取效率和节能环保角度考虑采用生物酶解技术提取匙羹藤总皂苷,将匙羹藤粉经木聚糖酶和纤维素酶协同处理后用水或醇提取三萜皂苷类化合物。 正交设计（orthogonal design） 是实验设计中一种较简便的方法。正交设计表现为一个正交排列,纵列是将要被研究的影响因素的数目,行数则根据实验需要来决定,每行结合了不同因素和水平成为了一个特殊独立的实验。正交实验能在所有实验方案中均匀地挑选出代表性强的少数实验,并且通过对这些少数实验的结果进行统计分析,得出较优的方案。正交设计尤其在因素间出现交互作用时的考察等方面,具有相当的优势。正交设计的关键优势能将实验次数限制在最低,同时却能提供较多的实验信息。我们应用L9（34）正交试验设计酶用量、酶解温度、酶解时间和PH值对三萜皂苷提取率的影响,确定酶法提取匙羹藤总皂苷的最佳工艺条件。该项目对环境无污染,对生态也无影响,研究所取得的成果及数据资料为科学有效环保地开发我区特色资源优势植物提供基础性的研究依据及拓展新的应用途径,为最大限度利用匙羹藤资源提供了科学依据。 抗衰老生物学和自由基生物学是近年来生命科学的研究热点,研究和开发新型抗氧化功能食品和天然抗氧化剂能满足人们对健康长寿日益增长的要求。过氧化脂质又名脂质过氧化物（Lipid peroxidation.LPO）是发生在细胞膜内多不饱和脂肪酸中的一系列自由基反应,它与衰老、肝疾病、氧中毒、休克、肿瘤等疾病密切相关,引起学术界的广泛注意。LPO的生成使细胞膜的脂质组成发生变化,并导致细胞膜内酶与蛋白质变性,破坏了细胞结构和功能,这种自由基导致脂质过氧化反应的非组织特异性,使得体内重要脏器的肝、心、脑都有受害的可能。因此,维持体内自由基的稳态平衡,清除有害的自由基反应,中断或终止脂质过氧化,减少过氧化脂质的产生和积累,对于延缓衰老、防御疾病十分重要。LPO测定已成为一项新的生化指标。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutases . SOD）广泛存在于各种生物体内, SOD是机体清除超氧阴离子自由基的一种重要酶,其活力的高低与衰老、肿瘤、炎症以及血液等疾病均有十分密切的关系。作为体内天然的抗氧化酶之一,其活力提高,有益于机体的抗氧化能力。 过氧化氢酶（Catalase.CAT）是一种抗氧化酶,它的生理作用主要是催化H2O2转变为H2O和O2。在红细胞中H2O2可以氧化血红蛋白成为高铁血红蛋白,但由于CAT清除了H2O2,遂不会发生这样的反应。CAT不仅存在于红细胞,而且还存在于组织细胞内微体中,因此微体中尿酸酶、D-氨基酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶的催化反应中所产生的H2O2都可以被CAT及时清除。在病理情况下CAT活性可能降低。据报导,CAT活性降低,可以增高畸变率,易患癌症等。 现在对许多基本的生命现象或疾病机理的探讨,都是在分子水平和细胞水平上进行研究的。在生物分子的化学反应过程中,由于分子中共价键分裂的方式不同,可分为离子型反应和自由基反应。在国外,自由基在生物体系中的作用,已是一个很活跃的研究领域。在一些生理、病理过程的研究中,发现它们与自由基反应有关,例如,在体内的某些正常的物质代谢过程中,有自由基中间产物生成;在白细胞吞噬和杀灭微生物的过程中,有自由基生成和作用;而在衰老、中毒及恶性肿瘤的发生发展及治疗过程中,有自由基反应,并起着重要作用 。 天然抗氧化活性成分的引入有利于清除由人体产生的过量的内源性活性氧自由基,阻断自由基对人体生物大分子的损伤,减少癌症及心脑血管疾病的发病几率。匙羹藤中含有丰富的天然抗氧化活性成分,主要含有三萜皂苷类、黄酮、多肽、生物碱等成分,其中皂苷类化合物是其主要活性成分。 本课题组通过匙羹藤对大鼠肝脏细胞抗氧化能力指标LPO、SOD、CAT的影响的研究,预测其对人体抗氧化作用的功效,为其做为功能性食品添加剂的开发利用提供科学依据及开发前景。 2．项目研究主要内容及任务书执行情况。 研究内容 ①.样品采集及植物分类鉴定。 ②．对匙羹藤植物茎和叶的化学成分进行定性分析。 ③.匙羹藤中三萜皂苷类成分的提取分离：将匙羹藤粉经木聚糖酶和纤维素酶协同处理后用水或醇提取三萜皂苷,应用L9（34）正交试验设计酶用量、酶解温度、酶解时间和PH值对三萜皂苷提取率的影响,确定酶法提取的最佳工艺条件。 ④.匙羹藤提取物中三萜皂苷类化合物（总皂苷）含量测定：以香草醛-冰醋酸-高氯酸混合液为显色剂,以甘草酸单铵盐为对照品,采用分光光度法测定匙羹藤提取物中总皂苷含量。 ⑤.建立简易、灵敏、可靠的生物活性筛选模型：运用大鼠肝脏细胞匀浆TBA比色法,在建立的实验模型下,给大鼠喂食不同浓度的匙羹藤提取物（三萜皂苷）,测定大鼠肝脏脂质过氧化产物丙二醛（Malon-di-aldehyde, MDA）的含量,用邻苯三酚自氧化法测大鼠 肝脏SOD活性,用铬酸醋酸钾比色法测定大鼠肝脏CAT的活性,研究匙羹滕提取物对大鼠肝脏LPO、SOD、CAT的影响。 各项实验考核指标均已按计划完成,已撰写论文1篇, 《生物酶解法提取匙羹藤总皂苷工艺的研究》已被北大核心期刊《时珍国医国药》录用,2015年8月发表,另一篇论文《匙羹藤总皂苷抗氧化活性研究》正在数据整理中,预期2015.6投稿 。 3．研究工作主要进展和所取得的成果。 研究工作主要进展：?通过对广西特色壮药匙羹藤植物中降糖有效成分（三萜皂苷类化合物）进行化学成分离、提取,解决了生物酶解技术提取分离匙羹藤中的三萜皂苷类成分的关键技术问题,确定酶法提取的最佳工艺条件,最大限度提高匙羹藤植物中三萜皂苷的提取率,建立一种高效、稳定、无污染的酶法提取匙羹藤三萜皂苷类化合物的新方法。 ?.建立匙羹藤总皂苷快速、简便、灵敏的分光光度定量分析方法。 ?.通过研究匙羹藤三萜皂苷类化合物的生物活性,建立匙羹藤总皂苷对大鼠肝脏线粒体LPO的作用,和对大鼠肝脏线粒体SOD、CAT活性影响的实验模型,结果：与对照组比较匙羹藤总皂苷在1.5mg/ml-8.5mg/ml浓度范围可抑制大鼠肝脏LPO作用;在1.0mg/ml-6..5mg/ml浓度范围内可提高大鼠肝脏SOD和CAT的活性。说明匙羹藤总皂苷可以提高大鼠肝脏SOD和CAT的活性,抑制LPO作用。 所取得的成果 一、生物酶解法提取匙羹藤总皂苷工艺的研究北大核心期刊《时珍国医国药》,2015,26（7）：1616-1617 二、匙羹藤总皂苷抗氧化活性的研究 《大众科技》,2015,17（11）：57-58