[01159820]微囊化技术在兽用生物制剂中的应用研究

研究内容一：EGFP标记的E.coli BL21示踪菌的构建及其在体内外模拟微囊化缓释制剂消化代谢规律的研究构建了EGFP标记的E.coli BL21重组菌（pET28a-EGFP重组菌）,制成具有耐胃酸且有较好肠溶性的示踪菌用于大肠杆菌在消化道的代谢规律探索。通过PCR鉴定、PCR产物测序、酶切鉴定、SDS-PAGE电泳鉴定、镜检都说明EGFP基因已成功转入并实现原核表达;通过对重组菌30代诱导观察EGFP稳定性研究表明,EGFP的表达不会对重组菌产生毒害作用,不会阻碍重组菌的正常生长,重组菌的遗传稳定性较好,EGFP与Kan双标记未消减,此重组菌可用于进一步微囊化缓释制剂在体内外消化代谢规律的示踪剂。 该项创新研究的主要内容涉及分子生物学、动物生理学以及微囊包被技术等学科,首创制备了一种高效表达GFP标记的大肠杆菌BL21消化道示踪菌,该项研究获得了发明专利授权（一种耐胃酸EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌的制备及工艺,ZL2013102800312）。 研究内容二：微囊化口服疫苗和促生长添加剂的制备工艺建立和优化 1.制备了微囊化羊致病性大肠杆菌口服灭活疫苗 通过羊大肠杆菌灭活疫苗制备,最佳佐剂筛选和微囊化包被各项工艺参数（单因素和多因素）筛选,最终确定最佳配方为壁材海藻酸钠溶液浓度为2%,芯材与壁材的比例为1：3,保护剂含量为2%,乳化剂含量为4%;最优工艺条件为进风温度为200℃,出风温度为90℃,蠕动泵速率为70 mL/h,均质速率为16000 rpm。制备了1种微囊化大肠杆菌口服疫苗新剂型。所制得的微囊化羊大肠杆菌口服疫苗平均粒直径为5.23±2.70μm。基于该研究申请了发明专利1项（一种微囊化大肠杆菌口服灭活疫苗的制备及工艺。专利受理号：2013102851244）。 2.制备了微囊化胆囊收缩素卵黄抗体（CCK－IgY） 2.1 胆囊收缩素卵黄抗体的制备 本研究以免疫技术为手段,用羊胆囊收缩素八肽（CCK-8）和载体蛋白-牛血清白蛋 白（BSA）偶联,主动免疫产蛋鸡,收集鸡蛋,采用水稀释法结合盐析沉淀法提取的卵黄抗体,经过SDS-PAGE 法进行检测可以看出,得到纯度较高、分子量约180KD左右、具有生物学活性的CCK 卵黄抗体（CCK-IgY）。BCA 标准回归方程为：y=0.1343x-0.0056, R2=0.9902,卵黄抗体浓度为14.14 mg/mL。 2.2 微囊化胆囊收缩素卵黄抗体的制备 采用锐孔-凝固浴法,将海藻酸钠与IgY 的混合溶液以一定下滴高度和速度,通过 0.45 mm 针头滴入成囊溶液（壳聚糖与CaCl2）中,迅速交联成壳聚糖-海藻酸钙微囊。反应30 min 后,所得微囊经去离子水洗涤,自然晾干备用;通过单因素和多因素筛选确定最终最佳配方为成囊溶液pH为5.5,壳聚糖浓度为0.4%,Cacl2 浓度为3%,海藻酸钠浓度为2.5%,芯壁比为1：3,包被率可达69.35%～80.28%。所获得的微囊化胆囊收缩素卵黄抗体外形呈圆球形,平均粒直径为1.047±2.05 mm,乳白色半透明状,相互之间无粘连,无不良气味。触之有韧性,具有良好的耐酸性和肠溶性。 研究结果获得发明专利授权1项（一种微囊包被卵黄源胆囊收缩素抗体的制备及工艺,ZL2013102800153）。 研究内容三：2种微囊化兽用生物制剂的应用效果研究 2012-2013年在新疆畜牧科学院绵羊中心实验羊场和2015-2016年在昌吉地区木垒县金冠畜牧业养殖有限责任公司湖羊养殖场分别对80只10-39日龄羔羊和120只10-40日龄湖羊羔羊进行了微囊化胆囊收缩素卵黄抗体（CCK-IgY）饲喂试验,与对照组相比,微囊包被的CCK-IgY饲喂可分别提高平均日增重为35克和60.3克。经过30天试验期可以显著增加羔羊体重1.0公斤和1.81公斤。2015-2016年在昌吉地区木垒县金冠畜牧业养殖有限责任公司湖羊养殖场对120只7日龄左右的羔羊进行免疫,微囊化羊大肠杆菌口服疫苗免疫羔羊后,腹泻率为0%,死亡率0%。35天腹泻免疫保护率100%。 研究内容四：微囊化兽用生物制剂研发的实验室技术体系建立与优化 1.建立了兽用生物制剂实验室微囊包被技术平台,建立了实验室喷雾干燥和常温包被技术体系。 2.自制了实验室常温凝固浴喷雾冷却塔装置1个。 3.建立了检测羊大肠杆菌血清抗体效价的间接ELISA方法,该研究申请发明专利1项（用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测检测方法及检测试剂盒,受理号：201610220735.4）。