[01147497]草酸脱羧酶对草酸钙晶体吸附功能区的构建

草酸脱羧酶（ Oxalate decarboxylase,Oxdc,EC 4.1.1.2） 是一种包含Mn2+的均一聚合酶,属于cupin蛋白超家族;它可以在没有辅因子的条件下催化草酸转化为甲酸和CO2,是植物、微生物中草酸代谢降解的主要催化酶。基于Oxdc对底物的高度特异性和酶促反应的高效性等特点,该酶已成功的应用于农业、食品、工业生产、医疗等领域中;尤其在泌尿系统草酸盐结石症方面的研究得到了广泛的关注。但在实际应用中,通过合理给药到达泌尿系统中的Oxdc酶制剂面临酶蛋白易被稀释流失的问题。因此,通过化学修饰法对Oxdc进行修饰改性,以进一步提高该酶的应用性能,为开发防治泌尿系结石症的酶制剂提供重要的理论参考。本研究的主要内容与结果如下： 1. 在体外模拟尿液体系中采用来源于Bacillus subtilis的Oxdc进行了草酸钙结晶重溶解的试验,通过测定催化反应体系中Ca2+的浓度变化,评价了Oxdc在体外溶解草酸钙结晶的能力及影响因素。结果表明,在10 mL反应体系中,添加4 U草酸脱羧酶,反应pH 3.0,反应温度为37℃,反应进行1周（168 h）,可使近5%的草酸钙结晶重新溶解;实验结果表明,草酸降解产物甲酸根对草酸脱羧酶促进草酸钙结晶溶解产生抑制作用。 2. 初步筛选了草酸钙晶体吸附分子,并研究了该吸附分子在草酸钙晶体上的吸附特性。研究结果表明,乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）的初始浓度增加以及升高温度有利于吸附进行,而吸附量随pH（5-8）的增加而减小。吸附动力学、吸附等温线、吸附热力学的分析表明：草酸钙晶体对EDTA的吸附符合拟二级动力学模型;Langmuir等温线模型较Freundlich等温线模型更适合描述EDTA在草酸钙晶体上的吸附过程;吸附是一个自发、吸热和熵增的过程。 3. 采用乙二胺四乙酸二酸酐（ethylenediaminetetraacetic dianhydride,EDTAD）对Oxdc进行了修饰,优化了修饰反应条件,当修饰反应时间为7 h、EDTAD/Oxdc的摩尔比为62:1、反应pH为6.2、反应温度为25℃时,修饰率为70.23%,酶活回收率为82.06%;分析了修饰后Oxdc的生物活性和结构变化,并探讨了EDTAD修饰对Oxdc部分酶学性质及催化吸附性能的影响。SDS-PAGE和UPLC-MS研究结果表明EDTAD与Oxdc共价结合,并表明EDTAD修饰Oxdc的位点位于Oxdc肽链上N末端的α-氨基上。紫外-可见吸收光谱、荧光光谱及圆二色性光谱分析表明经EDTAD修饰的Oxdc结构发生了一定程度的改变。酶促反应动力学分析表明EDTAD的修饰可增加Oxdc对底物的亲和力。与野生Oxdc相比,修饰酶的最适pH值向碱性方向偏移了大约1.5个单位,热稳定性、对胰蛋白酶的耐受性以及在草酸钙晶体上的吸附能力均显著提高。