[01136207]调控玉米大斑病菌发育与致病性的细胞信号转导网络

1、任务来源 本课题系国家自然科学基金委员会下达的国家自然科学基金项目：“玉米大斑病菌调控HT-毒素活性和特异性组分产生的MAPK信号转导基因”（编号30471126,起始年限2005-2007年,投入经费23万元）资助的课题。研究起始于2005年,主体内容完成于2007年12月,全部内容完成于2011年4月。由河北农业大学董金皋教授主持,郝志敏、李坡、巩校东、谷守芹4等同志共同协作,在河北农业大学等单位完成。按照项目要求,各研究人员充分发挥不同学科的优势,保证了项目的顺利完成。 2、技术原理 本课题属于应用基础研究,通过荧光素标记系统利用MAPK特异性抑制剂U0126研究大斑病菌MAPK途径可能的功能;通过生物信息学进行目的基因的的保守结构域分析、同源性分析、聚类分析,初步明确基因所处的信号途径及可能的功能;通过酿酒酵母功能互补分析目的基因对酵母相应基因缺失突变体表型回复情况分析目的基因功能;通过RT-PCR、Real time-PCR分析目的基因的表达规律,以佐证目的基因功能;通过RNAi、基因敲除技术创制相应的突变体分析突变体生长发育及致病性表型变化明确基因的功能。该项目明确了大斑病菌生长发育及致病性的信号转导为玉米大斑病的有效防治和新型杀真菌剂的研制奠定了基础,圆满完成了项目计划书中规定的任务。 3、性能指标 （1）任务要求：计划申请书要求达到以下性能目标 ①建立用于检测玉米大斑病菌MAPK活性的荧光素酶/荧光素技术体系。 ②克隆玉米大斑病菌MAPK信号通路关键酶基因,创制相应的突变体,明确MAPK信号通路在生长发育及致病性中的作用。 ③在国际学术刊物上发表论文1-2篇,在国内一级学报上发表论文3-4篇;培养博士生1-2名,硕士生2-4名;整体达到国际先进。 （2）实际达到原性能指标 通过植物病理学、分子生物学、生物信息学等多学科协作研究,已完成计划书原定任务,主要结果如下：①建立了一套检测玉米大斑病菌MAPK活性的荧光素酶/荧光素技术体系,利用该体系发现MAPK途径抑制剂U0126对病菌生长发育及致病性均有抑制作用;②克隆了病菌Hog1-homolog MAPK途径的3个相关基因,并利用生物信息学、酿酒酵母功能互补、RNAi、基因敲除技术明确了该途径的具有渗透调节及调控病菌生长发育的功能;③克隆了病菌Fus3/Kss1-homolog MAPK途径的2个相关基因,利用生物信息学、酿酒酵母功能互补、qRT-PCR、RNAi、基因敲除技术明确了该途径在病菌附着胞发育、侵入生长的致病性过程中有重要的调控作用;④克隆了病菌Slt2-homolog MAPK途径的2个相关基因,利用抑制剂的药物学实验、生物信息学、酿酒酵母功能互补、RNAi、基因敲除技术明确了该途径在病菌的细胞壁形态建成中有重要的作用;⑤培养博士3名,硕士16名;⑥发表论文23篇。 4、成果的创造性和先进性 ①建立了一套切实可行的检测玉米大斑病菌MAPK活性的荧光素酶/荧光素技术体系,利用该体系研究MAPK特异性抑制剂U0126对玉米大斑病菌的影响,初步明确MAPK信号途径在病菌生长发育及致病性中的作用。 ②利用酵母功能互补实验验证基因功能,发现STK2基因能恢复酿酒酵母Fus3/Kss1缺失突变体在假菌丝形成、侵入生长、子囊孢子发育等方面的功能,StSTE12基因可以回复酿酒酵母STE12基因确实突变体细胞的侵入生长的功能,STK1能恢复酿酒酵母Hog1确实突变体对渗透胁迫敏感的表型,STK3基因可以恢复酿酒酵母Slt2缺失突变体对CFW的敏感性,初步明确了这些基因所处的信号途径及可能的功能,为它们基因功能的研究奠定了基础。 ③通过玉米大斑病菌基因敲除及RNAi技术,明确基因对病菌菌丝发育、分生孢子产生、附着胞发育、HT-毒素活性及毒性组分致病性的调控作用,为玉米大斑病菌其他功能基因的研究建立了相关技术平台。 ④利用与基因互作的相关基因功能的研究来佐证基因的功能,不仅是对基因功能的验证,而且也阐释基因所处信号途径功能。