[01132406]生物催化合成手性取代芳基醇的平台技术研究

本项目应用催化剂工程、溶剂工程和过程工程等理论和技术手段,通过对微生物催化剂的筛选、相关酶基因的克隆和表达、高活性高选择性基因工程菌的构建、还原酶-脱氢酶双酶基因共表达、生物催化反应体系的构建、过程条件优化、工艺放大及产物的分离提取等方面开展系统研究,已完成的具体研究内容主要包括：建立了多个手性芳基醇对映体过量值的检测方法;从自然界中筛选获得了能够催化还原3,5-双（三氟甲基）苯基乙酮、2-（三氟甲基）苯基乙酮、3-氯苯乙酮等多个苯乙酮类化合物的活性较高、立体选择好的产酶菌株;通过发酵培养基的优化,获得最适合产酶条件用于制备生物催化剂;研究了生物催化不对称还原反应过程研究,得到最适手性芳基醇的制备工艺;探索了含有机溶剂反应体系中的反应过程优化;开展了生物催化剂的固定化研究,以提高催化剂的稳定性和利用率;构建了pET-28a（+）-LXCAR-S154Y-GDH重组质粒,使单质粒在宿主中成功表达双重组酶LXCAR-S154Y和GDH,获得具有双酶偶联的共表达体系的工程菌,并对重组工程菌E. coli BL（DE3）/pET-28a（+）-LXCAR-S154Y-GDH的酶活、蛋白表达量和催化3,5-双（三氟甲基）苯基乙酮的性能进行了考察,优化其表达条件,获得最优培养条件,用1 L摇瓶进行200 mL规模的转化实验,反应12 h,产率为86.5%,e.e.值≥99%;应用双酶偶联的共表达技术,构建了共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌,成功地用于不对称还原制备手性药物依替米贝（ezetimibe）关键中间体（4S）-3-[（5S）-5-（4-氟苯基）-5-羟戊酰基]-4-苯基-1,3-嗯唑-2-酮。 主要技术创新点：（1）从土壤中筛选获得的拥有自主知识产权的微生物菌株骚动厄斯考维菌（Oerskovia turbata）ZJPH1604及用于高立体选择性不对称还原3-氯苯乙酮。（2）从土壤中筛选获得的拥有自主知识产权的微生物菌株恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） ZJPH1606,用于不对称还原制备高光学纯的（R）-1-（2-三氟甲基苯基）乙醇的新工艺。（3）构建了2个羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶双酶基因共表达工程菌,分别用于催化还原3,5-双（三氟甲基）苯基乙酮、（4S）-3-[5-（4-苯基）-1,5-二氧戊纪]-4-苯基-1,3-嗯唑-2-酮,实现目的产物（R）-3,5-双三氟甲基苯乙醇（4S）-3-[（5S）-5-（4-氟苯基）-5-羟戊酰基]-4-苯基-1,3-嗯唑-2-酮的高效率制备。 该项目的研究成果拥有自主知识产权,项目组已申请了国家发明专利“一种厄斯考维菌及在制备（R）-3-氯苯乙醇的应用“（专利申请号：201611266505.8）;“一种恶臭假单胞菌及在制备（R）-1-（2-三氟甲基苯基）乙醇中的应用”（专利申请号：201710344320.2）; 本项目以取代苯乙酮类化合物的微生物催化不对称还原制备手性芳基仲醇为研究对象,应用催化剂工程、溶剂工程和过程工程等理论和技术手段,开发手性芳基醇的生物催化制备工艺,初步形成生物催化高效制备手性卤代芳基醇的平台技术。通过本项目的实施,充分发挥生物催化方法在手性化合物合成中的优势,促进手性技术的发展,将对我国省乃至我国手性材料和手性药物、特别是手性新药的研发起到有力的推动作用,助推我省生物医药行业的转型升级。