[01131699]S-腺苷蛋氨酸酶法合成关键技术及应用

S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）是广泛存在于生物体内的一种重要代谢中间体。在生物体内SAM是由L-蛋氨酸（L-Met）和三磷酸腺苷（ATP）经SAM合成酶（S-adenosylmethionine synthetase）催化合成,在国内外已经被广泛应用于医药和保健品领域。目前SAM的工业化生产主要是酵母菌发酵法,但是存在生产周期长（3-5天）、底物转化率低（约40%）、反应产物中具有活性的（-）SAM异构体含量低、纯化工序复杂、能耗高以及环保压力大等不足。相对于酵母菌发酵法,体外酶催化法生产SAM成本更低,生产工艺简单,更易于进行工业化生产,可以使SAM产品价格较大幅度降低,从而使消费者从SAM生产技术的进步中获得实惠。因此,体外酶催化合成SAM具有广阔的推广应用前景。 体外酶催化制备SAM的关键是通过重组表达技术获得大量廉价的SAM合成酶,同时通过固定化技术提高SAM合成酶的稳定性以及重复使用批次。基于以上分析,本项目构建了能高效组成型表达SAM合成酶的重组大肠杆菌,在10 L发酵条件下单位体积发酵液重组SAM合成酶活力比野生菌摇瓶培养提高了320倍,单位质量菌体重组酶活力比野生菌提高了约60倍,然后使用海藻酸钙固定化重组大肠杆菌细胞并进行通透化处理,使用处理的固定化整细胞以三磷酸腺苷（ATP）和L-蛋氨酸为底物催化合成S-腺苷蛋氨酸,底物浓度达到30mmol/L,35℃反应8h SAM合成量达到10～12g/L,底物转化率达到95%以上。 同时也对重组大肠杆菌表达的SAM合成酶进行了一步纯化,使用多种固定化酶载体对SAM合成酶进行了固定化研究,最终选取氨基树脂Seplite LX-1000HA用于制备固定化SAM合成酶,固定化酶活力回收率达到76%,半衰期为15～20批次,具有优良的操作稳定性,同时固定化酶的热稳定也得到大幅度提高。将固定化酶用于SAM的催化合成,在10L反应条件下35℃反应8h反应液中产物SAM的累积量达到10.8g/L,底物转化率达到95%,通过阳离子交换层析对SAM进行纯化,最终SAM的总收率达到70%。 本项目申请国家发明专利3项,已授权2项,对S-腺苷蛋氨酸的酶法合成的推广应用具有重要影响,发表相关论文十余篇。该专利技术已经转让给广东开平牵牛生化制药有限公司并实施生产,产品已经上市销售。2013年共生产和销售S-腺苷蛋氨酸1500公斤,新增产值375万元,新增利润112.5万元。