[01126541]基于基因组规模代谢网络模型的产琥珀酸放线杆菌GXAS137代谢工程改造

1.课题的来源与背景 （1）课题来源 本课题来源于国家自然科学基金课题“基于基因组规模代谢网络模型的产琥珀酸放线杆菌GXAS137代谢工程改造（31660022）”。 （2）课题背景 丁二酸是一种重要的中间化工产品替代苯合成250种以上的化工产品,从而可大大减少苯的使用对环境的污染。可广泛应用染料、医药、香料、农药、食品、油漆、照相和塑料材料工业。目前,全球丁二酸的市场需求量在3万-5万吨/年,预计2020年可达到20万吨/年。但是商品化的丁二酸主要是以石油等资源为原料采用化学法合成,存在以不可再生的石油资源为原料、污染大、成本高、能耗高等确定,而且其在医药、食品、饲料等行业的应用受到限制,严重抑制了丁二酸的发展潜力,不利于其大规模可持续发展。而微生物发酵生物质原料生产丁二酸则可摆脱这一限制,具有原料可以再生而且成本低廉,发酵过程条件温和、能耗低,可节约大量能源,发酵过程绿色环保,可固定大量CO2等优点,成为国内外研究的热点之一。产琥珀酸放线杆菌是众多产丁二酸的微生物中最具工业化潜力的菌株之一,但是存在优良的高产菌株很难获得,发酵过程中丁二酸浓度低、副产物高、发酵成本高等系列问题。 2.技术原理及性能指标 （1）技术原理 在前期丁二酸高产菌株GXAS137基因组测序、功能注释等基础上,本项目采用系统代谢工程的策略对菌株进行理性改造。首先构建基因组规模代谢网络模型（GSMM）,利用模型解析菌体生理代谢和产物合成机理,预测出显著提高丁二酸合成或副产物降低的改造靶点;再采用代谢工程及辅酶工程手段对选取靶点改造,增强主代谢途径、降低副产物代谢通量、调控细胞氧化还原状态,实现提高丁二酸浓度、降低副产物的目的。 （2）性能指标 构建基因组规模代谢网络模型（GSMM）,包含724个代谢基因相关的1075个酶反应,涉及714个代谢产物;解析了菌株代谢丁二酸及副产物的代谢网络,预测出显著提高丁二酸合成的关键位点磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（pepck）及副产物形成关键位点丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）及乙酸激酶基因（ack）。利用代谢工程手段获得工程菌株GXAS137-pepck,为解决菌株还原力缺乏问题,串联来源于大肠杆菌编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的zwf基因,重组GXAS137-pepck-zwf的丁二酸产量增加了11.6%;利用同源重组技术获得敲除菌株GXAS137-ΔpflB及GXAS137-Δack,副产物乙酸均降低13%以上。在获得工程菌的基础上,通过PB试验、正交及响应面等试验设计方法对工程菌发酵产丁二酸条件进行了优化,并对工程菌发酵木薯、糖蜜等广西的“非粮”生物质资源发酵产丁二酸进行了研究,丁二酸可达90 g/L。本课题实施过程中共发表论文8篇,其中SCI收录3篇,申请国家发明专利5项,其中3项获授权,培养硕士研究生2名。 3.技术的创造性与先进性 目前有关产琥珀酸放线杆菌生产丁二酸的研究主要集中在菌株筛选及发酵条件优化方面,而通过系统代谢工程改造的研究国内未见报道,因此,本项目处于国内领先水平。 4.技术的成熟程度,适用范围和安全性 目前,该项目的研究成果还处于实验室小试阶段,主要应用于微生物发酵产丁二酸生产,无安全问题。 5.应用情况及存在的问题 主要存在近几年石油价格持续走低,导致目前生物质能源及生物质材料产品无法与石油基产品竞争,随着石油价格上涨,及进一步选育高产菌株,降低丁二酸生产成本,经过进一步研发和放大研究,本项目将具有良好的经济效益和社会效益。 6.历年获奖情况 本项目尚未获得相关奖项。