[01115873]靶向型腺相关病毒载体的制备及应用

腺相关病毒（adenovirus-associated virus, AAV）作为一种备受关注的基因治疗载体,由于具有病原性低和携带的治疗基因表达期长等优势而成为目前最有前景的基因转移载体之一。 然而,在临床基因治疗过程中,AAV 具有广泛的宿主范围同时也导致缺乏组织或细胞特异性,对靶细胞的基因转染效率不高,同时也缺乏安全性。因此,提高重组AAV （rAAV）的靶向能力对于基因治疗成功与否非常关键。 提高病毒靶向能力的一条重要途径就是在病毒衣壳表面偶联一些靶向分子,带领病毒靶向特定组织、器官。所以,如何对AAV进行无破坏的高效标记及靶向修饰,凸显的尤为重要。目前的载体改造都是建立在靶向多肽的遗传插入或随机化学修饰基础之上的,但是尽管极尽所能,我们还是很难克服一些AAV本身固有的一些限制,如无法完全摒除病毒的天然嗜性、不能彻底解决修饰对病毒包装滴度的影响等问题。 因此,需要开发出新的具有位点特异性且不具有破坏性的技术来修饰腺相关病毒。 近年来本人一直在从事蛋白质的非天然氨基酸定点标记技术的研究工作,根据多年研究我们萌发了将该项技术应用在活病毒载体的定点标记上的设想。该设想的实现将有可能解决活病毒难以任意定点无破坏标记的世界性难题。由于病毒是由几十、甚至几百个蛋白包裹核酸组成的复杂生命单元,对它实现无破坏标记的难度将大大超过对单个蛋白的标记。该课题设想的难度大、不可控因素多,失败几率比较大。我们将这一课题设想申请北京市自然科学基金预探索项目的支持,并成功获得资助。在北京市自然科学基金的资助下,根据对AAV晶体结构分析,选择14个标记位点,并在其中6个位点成功地标记叠氮非天然氨基酸。利用该非天然氨基酸提供的叠氮基团,经点击化学反应,定向偶联了靶向分子（cRGD）,实现AAV靶向能力近30倍的提高,进而成功建立了AAV的定点标记及靶向修饰新方法,并将该方法申报PCT专利（定点突变和定点修饰的腺相关病毒、其制备方法及应用,申请号：PCT/CN2014/089880。）,目前已进入实质审查阶段,预计明年能够获得授权。部分研究结果已经发表一篇SCI论文（Zhang C, Yao T, et al. Biomaterials. 2016 Feb：80：134-45. IF=8.55）。通过这种方法,能够对AAV实施任意位点的定点叠氮标记和进一步无催化化学修饰,避免了以往研究中由于对病毒衣壳大幅度或非特异修饰,而造成的病毒包装效率低、活性差的后果,以及由于催化剂或剧烈化学反应对生物大分子造成的损伤。同时,新偶联的靶向基团以较高的自由度游离于病毒衣壳之外,可屏蔽病毒天然嗜性,展现新的靶向作用。总之,该方法为病毒的标记及修饰提供了一种崭新的途径。 更进一步,为验证AAV靶向修饰的设想,我们首先将RGD（精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸）分子定点偶联在AAV表面,引导病毒靶向整合素高表达的脑胶质瘤细胞,不但提高病毒的转导效率,病毒包裹HSV-TK（单纯疱疹病毒胸苷激酶）自杀基因后,在细胞水平靶向杀伤脑胶质瘤细胞的能力显著增强近30倍,使得脑胶质瘤的精准靶向治疗成为可能。另外,通过偶联不同的靶头分子,可以使得AAV靶向不同组织,制备出各类型的AAV靶向治疗载体、治疗药物等。AAV定点标记及靶向修饰新方法的建立,极大的推动基于AAV的基因治疗向更加安全、高效的方向迈出坚实一步,极有希望催生新一代的靶向基因治疗药物。