[01110903]基于水泡口膜炎病毒G蛋白介导的重组Multi BmNPV-Bacmid多基因表面展示系统

本课题经费来源于广东省自然科学基金管理委员会,依托华南农业大学,独立开展了“基于水泡口膜炎病毒G蛋白介导的重组Multi BmNPV-Bacmid多基因表面展示系统”等研究。昆虫杆状病毒展示系统是目前使用最为广泛的真核生物展示系统之一,具备安全、高效和经济等优势。野生型杆状病毒载体不感染人或哺乳动物,启动子活性强,外源基因表达水平高,具备较为完善的蛋白翻译修饰机制,目前在基因呈递、单克隆抗体制备和多联疫苗研发等领域具有重要的应用开发价值。 传统杆状病毒展示系统（BDS）受启动子表达时序性以及杆状病毒野生型 GP64 蛋白竞争的影响,造成外源基因展示效率低下。本研究首先通过缺失杆状病毒基因组的 gp64 基因、构建 IRES 介导的 gp64 补偿翻译,并换用早晚期启动子 p64 高效表达融合基因等方面提高展示效率。其次,利用申报人已建立的家蚕杆状病毒多基因表达系统（SBMES）,结合申报人开发的零背景 Tn7 转座、red-gam介导的高效同源重组和 Cre-loxp 位点的特异性重组,实现多种目的基因的共表达,并展示到重组病毒囊膜表面,达到开发多价疫苗、显著提高其适应范围和价值的目的。最后,通过目标蛋白与 VSV-G蛋白的融合表达,共展示到重组病毒表面,提高病毒感染性、降低细胞选择性,进一步提高机体免疫应答水平。 本研究构建了可高效率展示多个目标蛋白的MultiBac多基因共展示系统（SBMDS）,并检测了其对多个目标蛋白融合共展示能力和展示效率的研究。（1）利用细菌内同源重组Red-gam技术,构建出gp64基因缺失型MultiBac-△gp64;并利用内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）介导gp64基因的低拷贝表达和组装,拯救了gp64基因缺失导致的重组杆状病毒致死现象;（2）提取了VSV病毒RNA,逆转录获得G蛋白的基因序列,生物信息学方法对vsvg基因全序列进行了密码子使用频率分析,完成了vsvg基因的密码子优化工作;（3）利用egfp、eyfp和mCherry等荧光蛋白报告基因,完成了对gp64基因缺失型MultiBac-△gp64共展示平台的多基因展示能力的检测;并应用PCV2-orf2、PRRSV-gp5、CSFV-e2和InvasinC等完成了单病毒多抗原蛋白共展示的研究。（4）利用超速离心法完成了重组杆状病毒的浓缩与纯化,TEM技术完成了重组杆状病毒的鉴定。（5）利用双荧光素酶蛋白（Firefly luciferase、Renilla luciferase）完成了MultiBac-△gp64展示效率的检测,结果显示,囊膜蛋白GP64的低拷贝表达,可显著提高重组杆状病毒对目标蛋白的表面展示效率。上述研究成果已成功发表SCI论文3篇,授权国家发明专利1项,培养研究生3名。