[01110210]啤酒大麦转基因技术及籽粒蛋白质遗传表达调控研究

1、课题来源与背景 啤酒大麦是甘肃省区域特色优势产业,种植带位于河西走廊高水肥灌区。现种植品种对氮肥过于敏感、导致国产原料蛋白质含量超标是影响啤酒大麦产业健康发展的主要障碍。利用生物技术培育蛋白质含量适宜的啤用大麦是保障啤酒大麦产业健康发展的重要手段之一。为此,国家自然科学基金地区基金项目《啤酒大麦转基因技术及籽粒蛋白质遗传表达调控研究》于2014年立项。 2、研究的目的与意义 本项目拟应用RNAi对代谢的遗传调控理论,通过遗传工程操作引起相关基因“沉默”,从而达到改变籽粒蛋白质代谢途径,实现降低其醇溶蛋白质含量,进而降低籽粒粗蛋白质含量的目的。理论上,可为利用转基因技术改良作物品质提供新的理论依据和思路;在实践上,本项目将创造出对耐受高氮素的啤酒大麦种质资源,为选育低蛋白质含量、对氮肥不敏感的啤酒大麦新品种奠定物质基础。 3、主要论点与论据 本研究主要取得以下研究成果：（1）研究建立了较为成熟的啤酒大麦主要品种农杆菌介导转基因技术,转化率达1.3-6.3%,可以满足特定基因规模化转化的技术要求;（2）采用同源PCR方法克隆大麦B-hordein 核心保守序列2份 ,通过Gateway技术及限制性酶切、亚克隆构建RNAi植物表达载体2份,经农杆菌介导将RNAi 构件稳定转入啤酒大麦品种Goldern Promise 和甘啤4 号中, 2个转化事件多代（T5-T7）自交表现遗传稳定,获得稳定株系1份;（3）发育阶段B-hordein基因的qRT-PCR （SYBR Green Ⅰ）动态分析显示RNAi大麦表达量低于对照,且保持稳定;（4）开展氮肥控制试验和高氮肥诱导实验,采用近红外谷物分析仪及蛋白提取后Brandfrod定量两材料总蛋白、醇溶蛋白,并利用SDS-PAGE分析醇溶蛋白组分含量。实验结果表明：RNAi 株系与野生型对照相比,总蛋白显著低于对照1.33%,醇溶蛋白含量降低34.09%,差异极显著;醇溶蛋白组分分析显示,降低组分主要为B1、B3 亚基,降幅分别为22.87%、50.65%;高氮素条件下转基因大麦醇溶蛋白含量增加幅度显著低于对照。本研究结果不仅验证了RNAi对大麦籽粒蛋白质积累的调控作用,也为选育低醇溶蛋白、对氮肥不敏感的啤酒大麦新品种奠定基础,并为禾谷类作物品质改良提供有益借鉴。 4、创见与创新 与以往通过RNAi下调C组醇溶蛋白基因表达和5-甲基胞嘧啶 DNA 糖基化酶表达研究思路不同,本研究采用RNAi直接抑制B组醇溶蛋白基因表达获得蛋白质含量降低的啤酒大麦种质,在改良大麦酿造品质方面有一定创新。 5、社会经济效益 （1）RNAi转基因大麦的分子检测和氮素处理蛋白含量分析表明,本项目构建的B-hordein RNAi植物表达载体能够有效的降低转基因大麦的醇溶蛋白含量,是通过转基因技术改良作物品质的优良载体。 （2）获得的大麦转基因株系是大麦专用品种育种的优良种质资源,丰富了大麦种质资源库。 6、存在的问题 目前,还存在一些具体问题和不足,主要表现在：（1）研究提出的转基因技术对于不同基因型适应性不够好,转化效率需进一步提高,以降低试验成本;（2）醇溶蛋白B 和γ分子量接近,在SDS-PAGE 电泳条带分布中不易区分,因此还需要进一步采用蛋白组学相关研究手段,明确B 和γ醇溶蛋白组分。（3）醇溶蛋白在各种氨基酸的生物平衡上较差,本研究所获得的低醇溶蛋白转基因大麦其氨基酸种类和含量是如何变化？淀粉含量又是如何变化？这些需要进一步进行探讨。 6、历年获奖情况 本研究获得2016年度甘肃省农牧渔业丰收奖三等奖。